大黄素调控骨代谢治疗磨损颗粒导致骨溶解的实验研究
发布时间：2020-12-25 17:08
目的 假体周围骨溶解是人工关节置换术后最常见的远期并发症,摩擦界面释放的磨损颗粒导致的成骨环节的抑制及破骨环节的激活是骨溶解发生发展的重要原因。重塑正常骨代谢过程成为治疗骨溶解疾病的重要策略之一。本项目拟利用天然药物大黄素治疗钛颗粒诱导的骨溶解,明确其对于骨溶解反应中成骨及破骨环节的影响,并探讨其机制。方法 提取原代巨噬细胞及原代成骨细胞分别构建RANKL诱导的破骨细胞生成模型及磨损颗粒与成骨细胞共培养模型,体外模拟钛颗粒诱导骨溶解反应中成骨及破骨环节病理过程,采用TRAP染色、细胞骨架染色、骨吸收实验等方法评价大黄素对破骨细胞生成及功能的影响,采用ALP染色,茜素红染色等方法评价大黄素对磨损颗粒刺激下成骨细胞成骨功能的影响,通过western blot等手段检测MAPK,PI3K/AKT及NF-κB通路相关蛋白磷酸化水平的改变,探讨大黄素抑制破骨细胞生成及骨吸收功能可能的机制。在此基础上,体内构建出小鼠颅骨骨溶解模型,采用大黄素进行干预治疗,采用组织学切片及micro-CT等手段评价大黄素体内应用对钛颗粒诱导骨溶解的干预效果。结果 在破骨细胞实验中,TRAP染色结果显示大黄素显著抑制...
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CCK8测定大黄素作用于原代巨噬细胞的安全剂量范围
图 2 大黄素对破骨细胞生成的抑制作用。将原代巨噬细胞分别在含 30ng/ml M-CSF，100ng/ml sRANKL 和不同浓度大黄素的培养基中诱导培养。(A)不同浓度大黄素对破骨细胞生成的影响，（B)不同时期添加大黄素对破骨细胞生成的影响。所有实验均独立重复三次，相比较于对照组，*表示 p<0.05，**表示 p<0.01。所有数据均以均值±标准差形式展示。标尺=100μm。为检验大黄素对破骨细胞生成的抑制作用，我们将原代巨噬细胞培养于含sRANKL（100ng/ml），M-CSF（30ng/ml）及不同浓度（1.25μM，2.5μM，5μM，20μM）大黄素的 α-MEM 完全培养液中，培养 7 天后，光镜下可见对照组多核巨细胞的出现，并可被 TRAP 染色染为红色，证明成熟巨噬细胞的生成。而在实验组中，大黄素处理后使破骨细胞生成的数量及面积均显著降低，且这一效应呈剂量依赖性。为进一步确认大黄素的药效具体作用与破骨细胞分化的哪一时期。我们分别在破骨细胞诱导周期中的第 0-2 天，1-3 天，2-4 天及 3-5 天添加大黄素进行干预，结果发现，仅有 0-2 天及 1-3 天加药处理后破骨细胞生成的数量及面
图 3 大黄素对破骨细胞骨吸收功能的抑制作用。将原代巨噬细胞接种到 Corning OsteoAssay Surface 骨实验检测平板上，在含 sRANKL（100ng/ml）和 M-CSF（30ng/ml）的 α-MEM 完全培养液中诱导 4 天，见成熟破骨细胞生成后，分别加入含 sRANKL（100ng/ml），M-CSF（30ng/ml）及不同浓度大黄素的 α-MEM 完全培养液，继续培养 2 天，光镜下观察磷酸钙吸收情况并拍照。所有实验均独立重复三次，相比较于对照组，*表示 p<0.05，**表示p<0.01。所有数据均以均值±标准差形式展示。标尺=200μm。具有骨吸收能力是破骨细胞最为重要的特征，为了检验大黄素是否同时具有对成熟破骨细胞骨吸收功能的抑制作用，我们将原代巨噬细胞接种于含有磷酸钙包被的 Corning OsteoAssay Surface 骨实验检测平板上，在破骨细胞诱导液（含 RANKL 100ng/ml，M-CSF 30ng/ml）中培养 4 天，待成熟破骨细胞出现后，添加不同浓度的大黄素再继续培养 2 天，检测骨板内磷酸钙被吸收的程度。结果表明，对照组（OμM 组）磷酸钙侵蚀面积高达 38.36%，而分别经过1.25μM，2.5μM，5μM 及 20μM 大黄素处理后，大黄素的磷酸钙侵蚀面积下降
本文编号：2938062
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
CCK8测定大黄素作用于原代巨噬细胞的安全剂量范围
图 2 大黄素对破骨细胞生成的抑制作用。将原代巨噬细胞分别在含 30ng/ml M-CSF，100ng/ml sRANKL 和不同浓度大黄素的培养基中诱导培养。(A)不同浓度大黄素对破骨细胞生成的影响，（B)不同时期添加大黄素对破骨细胞生成的影响。所有实验均独立重复三次，相比较于对照组，*表示 p<0.05，**表示 p<0.01。所有数据均以均值±标准差形式展示。标尺=100μm。为检验大黄素对破骨细胞生成的抑制作用，我们将原代巨噬细胞培养于含sRANKL（100ng/ml），M-CSF（30ng/ml）及不同浓度（1.25μM，2.5μM，5μM，20μM）大黄素的 α-MEM 完全培养液中，培养 7 天后，光镜下可见对照组多核巨细胞的出现，并可被 TRAP 染色染为红色，证明成熟巨噬细胞的生成。而在实验组中，大黄素处理后使破骨细胞生成的数量及面积均显著降低，且这一效应呈剂量依赖性。为进一步确认大黄素的药效具体作用与破骨细胞分化的哪一时期。我们分别在破骨细胞诱导周期中的第 0-2 天，1-3 天，2-4 天及 3-5 天添加大黄素进行干预，结果发现，仅有 0-2 天及 1-3 天加药处理后破骨细胞生成的数量及面
图 3 大黄素对破骨细胞骨吸收功能的抑制作用。将原代巨噬细胞接种到 Corning OsteoAssay Surface 骨实验检测平板上，在含 sRANKL（100ng/ml）和 M-CSF（30ng/ml）的 α-MEM 完全培养液中诱导 4 天，见成熟破骨细胞生成后，分别加入含 sRANKL（100ng/ml），M-CSF（30ng/ml）及不同浓度大黄素的 α-MEM 完全培养液，继续培养 2 天，光镜下观察磷酸钙吸收情况并拍照。所有实验均独立重复三次，相比较于对照组，*表示 p<0.05，**表示p<0.01。所有数据均以均值±标准差形式展示。标尺=200μm。具有骨吸收能力是破骨细胞最为重要的特征，为了检验大黄素是否同时具有对成熟破骨细胞骨吸收功能的抑制作用，我们将原代巨噬细胞接种于含有磷酸钙包被的 Corning OsteoAssay Surface 骨实验检测平板上，在破骨细胞诱导液（含 RANKL 100ng/ml，M-CSF 30ng/ml）中培养 4 天，待成熟破骨细胞出现后，添加不同浓度的大黄素再继续培养 2 天，检测骨板内磷酸钙被吸收的程度。结果表明，对照组（OμM 组）磷酸钙侵蚀面积高达 38.36%，而分别经过1.25μM，2.5μM，5μM 及 20μM 大黄素处理后，大黄素的磷酸钙侵蚀面积下降
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