小檗碱抗肿瘤活性筛选及作用机制研究
发布时间：2021-04-01 05:07
小檗碱具有一定的抗肿瘤活性,先利用基因芯片测定小檗碱的基因表达谱数据,然后与CMap数据库作对比,预测小檗碱抗肿瘤的作用机制,再利用CCK-8法确定研究小檗碱抗肿瘤作用机制时所使用的肿瘤细胞。方法:首先用小檗碱处理MCF-7人乳腺癌细胞抽提出的RNA做基因芯片测定了小檗碱的基因表达谱数据,其中芯片类型为Affymetrix Human Genome U133A 2.0。通过小檗碱的基因表达谱数据与CMap数据库的对比,预测小檗碱可作为一种Hsp90抑制剂,也可作为一种HDAC抑制剂,或者可通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路促进肿瘤细胞的凋亡。然后通过CCK-8法测定小檗碱对几种实验室常用的肿瘤细胞的抑制活性,其中对SW480人结肠癌细胞的抑制活性最好,因此后续的验证实验选择SW480细胞。然后通过流式细胞仪检测了小檗碱对SW480细胞的凋亡、线粒体膜电位以及周期的影响。又通过Cellular thermal shift检测在SW480细胞中,小檗碱是否与Hsp90蛋白结合,通过Western blot检测小檗碱是否影响Hsp90客户蛋白的表达,部分在结肠癌中高表达的HDAC的几个亚...
【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
小檗碱的化学结构
能够推测出小分子药物可能的作用机制[19]。用不同浓度（如 10nm、100nm、1μM、10μM 等）的药物小分子处理不同的细胞株（如人皮肤黑色素瘤细胞 SKMEL-5，人乳腺癌细胞 MCF-7，人急性早幼粒白血病细胞 HL-60，人前列腺癌细胞 PC-3 等），处理的时间一般分为 6h 或者12h。处理之后将细胞收集并提取细胞中的 RNA，然后对提取的 RNA 进行纯度鉴定，最后进行表达谱基因芯片实验[20]。如果选用的细胞是 MCF-7，则可以用DMSO 处理 MCF-7 细胞作为空白对照组，用 β-雌二醇处理 MCF-7 细胞作为阳性对照组，所有样品均独立重复实验 3 次，然后可以得到药物小分子的基因表达谱数据。拿药物小分子的基因表达谱数据与 CMap 数据库作对比，会得到一系列化合物，这些化合物有相应的打分（即 Connectivity score）。根据所得的分数可以将这些化合物分为三类，-1 到 0 的化合物与药物小分子的作用呈负相关，越接近-1 则说明药物小分子与该化合物的作用相反的程度越高；反之，0 到 1 的化合物与药物小分子的作用呈正相关，且越接近 1 说明药物小分子与该化合物的作用越接近；如果为 0，则说明这些化合物基本上与药物小分子没有联系[21]。CMap 数据库建立的原理如图 1.2 所示：
图 2.1 BCA 测定的蛋白浓度标准曲线然后可以测定自己的蛋白样品浓度，在 96 孔板中选取一定数量的孔每孔加200μL的BCA工作液，再加入2μL的蛋白样品，每个蛋白样品设置两个复孔，且做好相应的标记，按照制作蛋白浓度标准曲线时的方式进行孵育，测出蛋品的 OD 值之后，与蛋白浓度标准曲线进行比对，即可计算出蛋白样品的浓配制凝胶：先将要用于配胶的玻璃板用超纯水清洗干净，然后将其固定在架上，加入足够量的超纯水用于检漏。15min 后，如果玻璃板中间的超纯水有明显漏掉，将配胶架倒置以使玻璃板中间的超纯水流出，并用吸水纸尽量璃板中间的超纯水吸收干净。完成之后，先按照 SDS-PAGE 分离胶配方表 2.1）配制分离胶，也就是下层胶，分离胶配制所需要的浓度可以由目标蛋分子量的大小来确定，理论上分子量越小的目标蛋白应选择浓度越高的分离。等所有成分依次加入后，将其涡旋充分混合均匀（注意时间不要过久，以在混匀的过程中凝固），然后取一定的量加入到玻璃板中间，再加入一定量
【参考文献】：
期刊论文
[1]小檗碱抗肿瘤作用机制的研究进展[J]. 张娟,李东霞. 医学综述. 2014(04)
[2]小檗碱抗肿瘤研究进展[J]. 王志红. 海峡药学. 2004(02)
本文编号：3112724
【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
小檗碱的化学结构
能够推测出小分子药物可能的作用机制[19]。用不同浓度（如 10nm、100nm、1μM、10μM 等）的药物小分子处理不同的细胞株（如人皮肤黑色素瘤细胞 SKMEL-5，人乳腺癌细胞 MCF-7，人急性早幼粒白血病细胞 HL-60，人前列腺癌细胞 PC-3 等），处理的时间一般分为 6h 或者12h。处理之后将细胞收集并提取细胞中的 RNA，然后对提取的 RNA 进行纯度鉴定，最后进行表达谱基因芯片实验[20]。如果选用的细胞是 MCF-7，则可以用DMSO 处理 MCF-7 细胞作为空白对照组，用 β-雌二醇处理 MCF-7 细胞作为阳性对照组，所有样品均独立重复实验 3 次，然后可以得到药物小分子的基因表达谱数据。拿药物小分子的基因表达谱数据与 CMap 数据库作对比，会得到一系列化合物，这些化合物有相应的打分（即 Connectivity score）。根据所得的分数可以将这些化合物分为三类，-1 到 0 的化合物与药物小分子的作用呈负相关，越接近-1 则说明药物小分子与该化合物的作用相反的程度越高；反之，0 到 1 的化合物与药物小分子的作用呈正相关，且越接近 1 说明药物小分子与该化合物的作用越接近；如果为 0，则说明这些化合物基本上与药物小分子没有联系[21]。CMap 数据库建立的原理如图 1.2 所示：
图 2.1 BCA 测定的蛋白浓度标准曲线然后可以测定自己的蛋白样品浓度，在 96 孔板中选取一定数量的孔每孔加200μL的BCA工作液，再加入2μL的蛋白样品，每个蛋白样品设置两个复孔，且做好相应的标记，按照制作蛋白浓度标准曲线时的方式进行孵育，测出蛋品的 OD 值之后，与蛋白浓度标准曲线进行比对，即可计算出蛋白样品的浓配制凝胶：先将要用于配胶的玻璃板用超纯水清洗干净，然后将其固定在架上，加入足够量的超纯水用于检漏。15min 后，如果玻璃板中间的超纯水有明显漏掉，将配胶架倒置以使玻璃板中间的超纯水流出，并用吸水纸尽量璃板中间的超纯水吸收干净。完成之后，先按照 SDS-PAGE 分离胶配方表 2.1）配制分离胶，也就是下层胶，分离胶配制所需要的浓度可以由目标蛋分子量的大小来确定，理论上分子量越小的目标蛋白应选择浓度越高的分离。等所有成分依次加入后，将其涡旋充分混合均匀（注意时间不要过久，以在混匀的过程中凝固），然后取一定的量加入到玻璃板中间，再加入一定量
【参考文献】：
期刊论文
[1]小檗碱抗肿瘤作用机制的研究进展[J]. 张娟,李东霞. 医学综述. 2014(04)
[2]小檗碱抗肿瘤研究进展[J]. 王志红. 海峡药学. 2004(02)
本文编号：3112724
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