AKT/c-Met共表达诱导肝细胞癌形成的作用机制及雷公藤红素的干预作用研究

发布时间：2021-05-07 17:12

　　目的:肝细胞癌（HCC）是临床常见的实体瘤之一,在全球最常见癌症中致死率排名第三,是一种严重危害人类健康的重大疾病。目前治疗HCC的方法有限,仅部分患者在发病时可行手术治疗,且复发转移率超过60%,治疗效果欠佳;FDA批准的晚期肝癌治疗药物多靶向小分子激酶抑制剂索拉非尼（Sorafenib）仅能延长寿命2-3个月,且易出现不良事件。因此,研究HCC发生的分子机制,探讨其新的治疗方法就显得尤为重要和迫切。原癌基因突变或异常表达引起细胞信号通路失控,从而介导细胞异常增殖或抑制细胞程序性死亡,最终形成HCC,是肝细胞癌变的主要机制之一。研究表明,原癌基因AKT与c-Met过表达或异常激活是HCC发生发展过程中的高频事件,针对AKT或c-Met介导HCC发生发展的作用机制已有报道。然而,AKT与c-Met在肝癌发形成中的协同作用及分子机制,至今仍不十分清楚。雷公藤红素（Celastrol,又名南蛇藤素）是从中药雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）、南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.）等卫矛科植物中的单体化合物,对结肠癌、肺癌、肝癌... 

【文章来源】：湖北中医药大学湖北省

【文章页数】：132 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略词表
前言
第一章 AKT/c-Met共表达促进肝细胞癌的快速形成研究
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 实验试剂
        1.3 实验仪器
    2 实验方法
        2.1 质粒提取及鉴定
        2.2 注射质粒溶液的配制
        2.3 高压尾静脉转染法
        2.4 实验分组
        2.5 小鼠肿瘤大体形态检测
        2.6 苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosinstaining,HE)
        2.7 免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色
        2.8 组织中RNA提取和即时聚合酶链式反应(Quantitative Real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测
        2.9 溶液配制
        2.10 统计学方法
    3 实验结果
        3.1 同时共转染AKT和c-Met诱导小鼠肝脏肿瘤的快速形成
        3.2 AKT/c-Met诱导小鼠肿瘤形成是由于转染AKT和c-Met引起
        3.3 AKT和c-Met诱导的肝脏肿瘤组织学形态为肝细胞癌
        3.4 AKT/c-Met诱导小鼠肿瘤的分子生物学特征为肝癌
    4 小结与讨论
第二章 AKT/c-Met共表达促进肝细胞癌形成的分子机制研究
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 细胞系
        1.3 体外实验用药物
        1.4 主要试剂及耗材
        1.5 抗体
        1.6 主要仪器
    2 实验方法
        2.0 质粒提取及鉴定
        2.1 shRNA的构建
        2.2 注射质粒溶液的配制
        2.3 高压尾静脉转染法
        2.4 动物实验分组
        2.5 细胞培养
        2.6 细胞药物干预实验
        2.7 细胞增殖实验
        2.8 细胞凋亡实验
        2.9 组织/细胞蛋白的提取和Westernbloting
    3 实验结果
        3.1 AKT/c-Met共表达促进AKT/mTOR和Ras/MAPK信号通路的激活
        3.2 沉默Raptor基因可抑制AKT/c-Met共表达诱导的小鼠HCC形成
        3.3 敲除FASN基因可抑制AKT/c-Met共表达诱导的小鼠肝癌形成
        3.5 联合抑制AKT和c-Met不利于人源肝癌细胞生长
    4 小结与讨论
第三章 AKT、c-Met和FASN在人体HCC中共表达研究
    1 实验材料
        1.1 主要试剂及耗材
        1.2 抗体
        1.3 实验仪器
        1.4 人体HCC病理标本
    2 实验方法
    3 实验结果
    4 小结与讨论
第四章 雷公藤红素抗AKT/c-Met诱导的HCC作用及机制研究
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 体外实验用药物
        1.3 主要试剂及耗材
        1.4 抗体
        1.5 主要仪器
        1.6 给药溶液的配制
    2 实验方法
        2.1 质粒提取及鉴定
        2.2 注射质粒溶液配制
        2.3 高压尾静脉转染法
        2.4 动物实验分组
        2.5 苏木精-伊红(HE)染色
        2.6 免疫组织化学(IHC)染色
        2.7 组织中RNA提取和即时聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测
        2.8 组织蛋白的提取和Westernbloting
        2.9 统计学方法
    3 实验结果
        3.1 Celastrol有效的抑制AKT/c-Met诱导小鼠HCC的肿瘤生长
        3.2 Celastrol减轻AKT/c-Met诱导小鼠HCC肝脏病理学变化
        3.3 Celastrol降低AKT/c-Met诱导小鼠HCC肝脏和血清中肝癌标志物的表达水平
        3.4 Sorafenib对AKT/c-Met诱导的小鼠HCC无效
        3.5 Celastrol下调AKT/c-Met诱导小鼠HCC肝脏中Ki67和PCNA的表达水平
        3.6 Celastrol抑制AKT/c-Met诱导小鼠HCC肝脏中AKT/mTOR和Ras/MAPK相关蛋白的表达水平
    4 小结与讨论
第五章 雷公藤红素长循环脂质体的制备、表征及细胞学行为初步研究
    1 实验材料
        1.1 药品及试剂
        1.2 主要仪器
    2 实验方法
        2.1 雷公藤红素体外分析方法的建立
        2.2 脂质体包封率的测定
        2.3 雷公藤红素脂质体(Celastrol/L)的制备
        2.4 雷公藤红素长循环脂质体(Celastrol/PEG-L)的制备及表征
        2.5 Celastrol/PEG-L贮存稳定性考察
        2.6 Celastrol/PEG-L冻干工艺的考察
        2.7 体外释放行为研究
        2.8 细胞摄取动力学
        2.9 雷公藤红素及脂质体细胞毒作用
    3 实验结果
        3.1 雷公藤红素体外分析方法的建立
        3.2 过膜法测定脂质体包封率的验证
        3.3 雷公藤红素脂质体(Celastrol/L)的制备
        3.4 雷公藤红素长循环脂质体(Celastrol/PEG-L)的制备及表征
        3.5 Celastrol/PEG-L贮存稳定性考察
        3.6 Celastrol/PEG-L冻干工艺的考察
        3.7 雷公藤红素普通脂质体和长循环脂质体体外释放
        3.8 细胞摄取动力学
        3.9 细胞毒作用
    4 小结与讨论
结语
参考文献
附录1 肝细胞癌的研究进展
附录2 攻博期间获得的科研成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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[3]Current status and perspectives of immune-based therapies for hepatocellular carcinoma[J]. Maridi Aerts,Daphné Benteyn,Hans Van Vlierberghe,Kris Thielemans,Hendrik Reynaert.  World Journal of Gastroenterology. 2016(01)
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本文编号：3173769