Rictor在血管新生及成熟中的作用机制研究

发布时间：2022-10-29 21:24

　　缺血性疾病如:脑缺血、肢体缺血、心肌缺血等已成为威胁人类健康的杀手之一。目前,促进缺血后血管新生,改善侧支循环来治疗缺血性疾病已成为心血管领域的研究热点。在血管生成至成熟过程中血管内皮细胞（endothelial cells,ECs）起到极其关键的作用。已有相关研究表明m TOR-Rictor在调节内皮细胞功能中发挥重要作用,但其在血管形成至成熟过程中的作用机制还不明确。本课题前期研究表明Rictor缺失后,小鼠术后缺血区新生血管数量虽有增加但相对正常血管内皮细胞排列絮乱且形态不规则。为了验证Rictor在血管成熟中是否发挥作用及探索其作用机制,本课题通过利用m TOR阻断剂KU0063794及m TORC1阻断剂Rapamycin,缺氧环境下,细胞水平间接推测m TOR-Rictor在缺血后血管成熟中的作用机制,并通过整体动物水平及细胞水平RNA干扰验证m TOR-Rictor在血管成熟中作用。方法:1、原代培养小鼠胸主动脉内皮细胞（mouse aortic endothelial cells,MAECs）,用免疫荧光方法鉴定MAECs。采用体外i CELLigence实时细胞分析系... 

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
中英文名称对照与缩略词表
引言
实验研究
    第一部分 细胞水平，KU0063794、Rapamycin间接检测Rictor在血管生成过程中的作用机制研究
        1.实验材料
            1.1 实验动物
            1.2 实验药物
            1.3 主要试剂
            1.4 主要仪器
            1.5 药物及试剂配制
        2.实验方法
            2.1 MAECs原代培养
            2.2 细胞复苏与冻存
            2.3 细胞计数
            2.4 免疫荧光法鉴定MAECs
            2.5 CCK8法测定药物对MAECs生存影响
            2.6 iCELLigence实时细胞分析系统检测药物对MAECs增殖的影响
            2.7 mTOR-Rictor对细胞侵袭、迁移能力的影响
                2.7.1 侵袭实验
                2.7.2 划痕实验
            2.8 MAECs成环实验
            2.9 缺氧情况下酶联免疫法（ELISA）检测VEGF、ANG1的释放量
            2.10 Rictor对血管新生及成熟过程中相关蛋白表达变化的影响
                2.10.1 用于蛋白印迹溶液的配制
                2.10.2 MAECs和内皮组织总蛋白的提取和定量
                2.10.3 凝胶配置、电泳
                2.10.4 转膜
                2.10.5 抗体结合
                2.10.6 ECL化学发光检测
        3.统计学分析
        4.结果
            4.1 MAECs的形态观察
            4.2 免疫荧光鉴定MAECs
            4.3 KU0063794及Rapamycin对MAECs存活的影响
            4.4 Rictor对MAECs迁移、侵袭能力的影响
            4.5 Rictor对MAECs成环能力的影响
            4.6 酶联反应法测量VEGF、ANG1结果
            4.7 Rictor的表达变化对血管形成成熟的相关蛋白影响
        5.讨论
        6.结论
    第二部分 细胞水平及动物水平，RNA干扰验证Rictor对血管生成的调节作用
        1.实验材料
            1.1 实验动物
            1.2 实验试剂及仪器
        2.实验方法
            2.1 细胞水平干扰Rictor表达
                2.1.1 脂质体转染MAECs
                2.1.2 细胞蛋白提取
                2.1.3 western blotting实验
                2.1.4 总RNA提取（Trizol法）
                2.1.5 逆转录
                2.1.6 QPCR检测
                2.1.7 酶联免疫法测ANG1含量
            2.2 动物水平验证Rictor在血管生成中作用
                2.2.1 小鼠下肢缺血模型建造
                2.2.2 体内Rictor干扰实验
                    2.2.2.1 组织蛋白提取
                2.2.3 免疫荧光法检测Rictor下调术后7天，血管新生情况
        3.统计学分析
        4.实验结果
            4.1 western blot检测Rictor下调后血管生成相关蛋白的表达变化
            4.2 QPCR结果
            4.3 Rictor下调后MAECs中ANG1含量测定结果
            4.4 小鼠下肢缺血造模血管位置
            4.5 体内干扰Rictor结果
            4.6 免疫荧光法检测Rictor下调术后小鼠血管新生情况
        5.讨论
        6.结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]三七及三七花总皂苷对斑马鱼模型促血管新生作用的研究[J]. 张哲睿,黎晌,王佑华,李铭源,唐靖一,刘萍,周昕,魏莉,周端.  上海中医药大学学报. 2013(01)
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[3]泰山白花丹参提取物对人脐血内皮祖细胞增殖、黏附及分泌NO的影响[J]. 焦鹏,常起,陈彬,杨娜娜,唐瑜菁,夏作理.  中华中医药杂志. 2011(11)
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[6]西洋参茎叶总皂苷对急性心肌梗死大鼠心肌VEGF、bFGF表达及血管新生的影响[J]. 王承龙,史大卓,殷惠军,陈可冀.  中国中西医结合杂志. 2007(04)
[7]黄芪提取物对人脐静脉内皮细胞的促血管新生作用[J]. 张燚,胡光,洪思佳,刘倩青,李铭源,王一涛.  中药药理与临床. 2007(02)
[8]红景天与绛香对心肌梗死大鼠血管抑素和内皮抑素表达的影响[J]. 张玉英,李剑,范维琥,李勇,施海明.  中西医结合心脑血管病杂志. 2005(12)
[9]血管生成、治疗性血管生成和抗血管生成[J]. 卞修武.  第三军医大学学报. 2001(03)
[10]槲皮素对血管内皮细胞损伤的保护作用[J]. 林蓉,刘俊田,李旭,陈葳.  中国循环杂志. 2000(05)

硕士论文
[1]Rictor/mTORC2在小鼠ES细胞体外定向分化为心肌细胞的表达调控研究[D]. 郑蓓.浙江大学 2014



本文编号：3698444