VEGF/VEGFR在HSC/SEC共培养体系中的表达及疏肝健脾活血方的干预机制研究

发布时间：2023-03-11 15:18

　　目的基于肝纤维化时血管新生的病理机制,以肝纤维化不同时期的肝窦内皮细胞(SEC)与VEGF过表达的肝星状细胞(HSC)共培养为实验材料,探讨疏肝健脾方含药血清对VEGF调控的抗肝纤维化机制,并确定该方的最佳干预时相。方法1.分离正常大鼠HSC及SEC,大鼠皮下注射CCl4制备肝纤维化模型,分别于造模的第2w、4w、8w分离模型大鼠SEC;2.针对大鼠VEGF基因构建sh RNA重组慢病毒,转染体外培养的HSC,共聚焦显微镜检测转染后HSC绿色荧光蛋白表达、免疫印迹蛋白(Western Blot)检测VEGF蛋白表达;3.中浓度疏肝健脾活血方行大鼠灌胃制备含药血清,得到含药血清后配置为不同浓度的含药血清培养基作用于HSC,MTT法检测不同浓度的疏肝健脾活血方含药血清对HSC增殖的影响,确定含药血清最佳有效浓度;4.分别取2w、4w、8w三个时间点分离得到的正常大鼠HSC和SEC、肝纤维化模型大鼠SEC、转染得到的VEGF过表达HSC分为如下6组:H组:正常大鼠HSC完全培养基培养;HS组:正常大鼠HSC和正常大鼠SEC完全培养基共培养;HM组:正常大鼠HSC和模型大鼠SEC完全培养基共培...

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中文摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 大鼠HSC及SEC原代分离实验研究
    一、材料与方法
        (一)实验材料
            1.实验动物
            2.主要实验试剂
            3.主要仪器设备
            4.主要试剂配制
        (二)实验方法
            1.模型制备
            2.HSC及SEC分离
            3.台盼蓝计数及免疫荧光鉴定
    二、结果
        (一)光镜下观察结果
        (二)台盼蓝计数结果
        (三)免疫荧光鉴定结果
第二部分 shRNA重组慢病毒感染大鼠HSC过表达VEGF实验研究
    一、材料与方法
        (一)实验材料
            1.实验细胞
            2.主要实验试剂
            3.主要仪器设备
        (二)实验方法
            1.慢病毒载体的构建
            2.病毒包装
            3.病毒感染HSC
            4.嘌呤霉素筛选稳定转染细胞
            5.指标检测
            6.统计方法
    二、结果
        (一)慢病毒PCR测序结果
        (二)荧光倒置显微镜下观察转染后HSC细胞绿色荧光蛋白的表达变化
        (三)转染后VEGF相对表达量
第三部分 VEGF/VEGFR在HSC/SEC共培养体系中的表达及疏肝健脾活血方的干预作用
    一、材料与方法
        (一)实验材料
            1.实验动物及实验细胞
            2.实验药材
            3.主要实验试剂
            4.主要仪器设备
            5.PCR引物和扩增片段长度如下
        (二)实验方法
            1.含药血清制备
            2.MTT法确定最佳含药血清浓度
            3.细胞分组及干预
            4.指标检测
            5.统计学方法
    二、结果
        (一)最佳含药血清的浓度确定
        (二)各组HSC活力及增值率
        (三)各组SEC中CD31、vWF蛋白相对表达量比较
        (四)各组中HSC的胶原Ⅳ、VEGF、VEGFR-2蛋白相对表达量比较
        (五)各组中HSC的VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2mRNA相对表达结果
    三、分析与讨论
        (一)VEGF在血管新生中起重要作用
        (二)VEGF在肝纤维化发展中促进病理性血管新生
            1.SEC与肝窦毛细血管化
            2.VEGF加重肝窦毛细血管化促进肝纤维化发展
            3.VEGF促进血管网络形成加重血液分流
            4.VEGF增加血管通透性并加重炎症反应
        (三)中医学对肝纤维化中病理性血管新生的认识
            1.病名的认识
            2.病因病机
            3.中医治则治法
            4.疏肝健脾活血方的组方及功效
        (四)实验结果分析
            1.SEC失窗孔后加重肝纤维化
            2.VEGF在肝纤维早期即促进肝窦毛细血管化的发展
            3.疏肝健脾活血方对肝纤维化时病理性血管新生干预的作用机制
结论
参考文献
附图
致谢
文献综述
    参考文献



本文编号：3759759