α治疗肩袖疾病患者肩峰下滑囊炎的实验研究

发布时间：2017-02-23 17:10

本文关键词：肩部电针与康复训练治疗肩撞击综合征的疗效比较，由笔耕文化传播整理发布。

《第二军医大学》 2012年

siRNA双靶向干扰IL-1β/TNF-α治疗肩袖疾病患者肩峰下滑囊炎的实验研究

眭杰

【摘要】：肩袖疾病（rotator cuff disease, RCD）是引起肩周疼痛、肩关节功能障碍的最常见原因。随着细胞生物学和分子生物学的发展，我们对于肩袖疾病形成机理及有了更深入的认识。逐渐认识到：肩峰下滑囊炎（subacromial bursitis）是导致肩袖疾病患者肩痛及功能障碍的重要原因。肩峰下滑囊细胞是肩峰下滑囊炎的核心细胞，非特异性刺激（机械牵拉、缺氧、炎性细胞及临近肩袖腱细胞）可通过囊壁上的压力或化学感受器刺激其分泌IL-1、TNF-α，MMP-1、MMP-9、COX-1、COX-2、SDF-1、P物质及VEGF多种炎性因子形成了一个调控慢性炎症反应的网络，而IL-1β及TNF-α是这个炎性网络的关键因子。遗憾的是，尽管大理的研究都证实了这些细胞因子对肩峰下滑囊炎的起病与发展起到了十分重要的作用，但大都仅局限在机制的探讨上，尚未有应用这些因子治疗肩袖疾病患者肩峰下滑囊炎的相关报道。小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)是含有21～23bp的双链RNA,可以序列特异性地切割靶RNA,介导转录后基因沉默，抑制蛋白质的合成，而不诱导非特异性的双链RNA反应。近年来，RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在基因治疗领域发展极为迅速。到目前为止，国内外尚未有应用RNAi技术肩袖疾病的相关报道。本实验中，我们利用siRNA双靶向干扰肩峰下滑囊细胞的IL-1β及TNF-α基因，评价IL-1β及TNF-α基因剔降效果及对这个炎性网络中其它炎性因子的影响。目的旨在明确肩峰下滑囊细胞类型及病理特征；探讨利用RNAi手段沉默人肩峰下滑囊细胞IL-1β及TNF-α基因的可行性；评价IL-1β及TNF-α基因剔降效果及对这个炎性网络中其它炎性因子的影响；进一步揭示肩袖疾病肩峰下滑囊炎发病机制及IL-1β及TNF-α在其炎性环路中的作用；为肩袖疾病临床治疗、未来基因治疗及药物筛选提供重要理论依据。方法 1.取肩袖疾病患者肩峰下滑囊标本，，通过平面培养的方法，采用改良双酶消化法分离、体外培养、纯化肩峰下滑囊细胞，观察细胞形态，通过H-E染色、Vimentin及CD68免疫荧光染色鉴定明确细胞类型。 2.设计合成针对人IL-1β基因序列特征设计特异siRNA-(1-3)，及针对人TNF-α基因序列特征设计特异siRNA-(a-c)，以阳离子脂质体为载体，转染体外培养的肩峰下滑囊细胞；FAM荧光标记，测定转染率，观察转染后细胞形态。Westen blot筛选出针对IL-1β及TNF-α基因的有效siRNA序列，进一步通过Realtime-PCR检测siRNA抑制肩峰下滑囊细胞IL-1β及TNF-α基因表达效果及剂量、时间相关性。 3.利用筛选出的针对IL-1β及TNF-α基因的有效siRNA序列，双靶向干扰肩峰下滑囊细胞，Realtime-PCR检测IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-9、COX-1、COX-2及SDF-1等细胞因子表达水平，以不加siRNA的滑囊细胞做空白对照，评价IL-1β及TNF-α基因剔降后对这个炎性网络中其它炎性因子的影响。结果 1.人肩峰下滑囊原代细胞贴壁良好。传至第3代后以长梭形细胞均匀生长。HE染色，普通光镜下，细胞呈梭型，核呈圆形，较大，核仁明显，免疫荧光结果显示Vimentin阳性，CD68阴性，符合成纤维样滑膜细胞特征。 2. FAM荧光标记后测定转染率都在80％以上，观察转染后细胞形态及生长均无明显影响；Westen blot结果显示IL-1β-siRNA-2及TNF-α-siRNA-c相对基因抑制水平最强；Realtime-PCR检测显示siRNA抑制肩峰下滑囊成纤维样滑膜细胞IL-1β及TNF-α基因表达时存在相似的剂量、时间相关性，随siRNA终浓度增加，抑制效率增强；转染后24h抑制最强，48h后逐渐减弱。 3. siRNA-2、siRNA-c均以终浓度200nmol／L同时转染肩峰下滑囊成纤维样滑膜细胞，以不加siRNA的滑囊细胞做空白对照，Realtime-PCR结果显示：转染后IL-1β及TNF-α的表达被明显抑制。MMP-1、MMP-9、COX-1的抑制效果同对照组相比有显著差异， COX-2、SDF-1的抑制效虽不显著，但仍有抑制。结论 1.采用改良双酶消化法可成功扩增并获得相当数量的肩峰下滑囊细胞。 2.经鉴定，肩峰下滑囊细胞培养至第3代为纯度较高的成纤维样滑膜细胞。 3.化学合成的IL-1β、TNF-α特异siRNA通过脂质体瞬时转染可以有效抑制肩峰下滑囊成纤维样滑膜细胞IL-1β、TNF-α基因的表达。 4. siRNA抑制肩峰下滑囊成纤维样滑膜细胞IL-1β及TNF-α基因均存在良好的剂量、时间相关性。 5.利用siRNA双靶向干扰技术可成功剔降IL-1β、TNF-α基因的表达，并同时下调了炎性网络中炎性因子MMP-1、MMP-9、COX-1、COX-2及SDF-1的表达。对炎性网络有明确的抑制作用。 6.从另一面证实了在肩峰下滑囊炎炎性网络中，IL-1β、TNF-α作为关键因子与其它炎性因子存在正反馈关系。 7.应用RNAi技术对肩峰下滑囊炎慢性炎症反应环路中的多个靶点进行调控可能是未来治疗肩峰下滑囊炎乃至肩袖疾病的有效途径。

【关键词】：
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R686
【目录】：

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【引证文献】

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1 胡宗强;CTGF基因RNA干扰干细胞对大鼠肝纤维化的治疗作用[D];昆明医科大学;2013年

【参考文献】

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1 彭卫华,侯凡凡,蒋建平,张训;改良的胶原酶滑膜细胞分离培养法[J];第一军医大学学报;2000年05期

2 孙铁铮,吕厚山,药立波,燕太强,杨刚;染料木黄酮对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞生长的影响[J];中华风湿病学杂志;2000年05期

3 曾永柏;;温针灸配合推拿手法治疗肩峰下滑囊炎31例[J];河南中医;2011年01期

4 黄为民;罗颖;黄丽佳;杨虹;冉春风;;体外冲击波治疗肩峰下滑囊炎的疗效分析[J];齐齐哈尔医学院学报;2009年13期

5 崔芳;王惠芳;王予彬;孙文琳;李振华;崔莉;潘惠娟;;康复训练对运动性肩袖损伤微创术后患者肩关节功能恢复的影响[J];中国康复医学杂志;2008年01期

6 王晓滨,黄公怡,孙常太,张耀南;肩袖损伤后修复的实验研究[J];中华骨科杂志;2002年11期

【共引文献】

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1 汪滋民;眭杰;年申生;王谦;康一凡;;关节镜下全面处理肩峰下撞击综合征及其合并症[J];第二军医大学学报;2011年03期

2 杨晓军;;一株耐酸链霉菌菌丝体化学成分的研究[J];第二军医大学学报;2011年05期

3 柏干苹;周丽娜;贺伟峰;罗高兴;陈烯伟;易绍萱;胡晓红;石东文;陈光兴;方勇飞;吴军;;人骨关节炎滑膜成纤维细胞差异蛋白质谱初步分析[J];第三军医大学学报;2006年11期

4 张莹;方勇飞;王勇;李景怡;黄小鲁;;青藤碱对类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞体外增殖及凋亡的影响[J];第三军医大学学报;2007年12期

5 柏干苹;周丽娜;贺伟峰;罗高兴;陈烯伟;陈光兴;胡晓红;石东文;方勇飞;吴军;;类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞的差异蛋白质谱分析[J];第三军医大学学报;2008年02期

6 柏干苹;周丽娜;贺伟峰;罗高兴;陈烯伟;陈光兴;胡晓红;石东文;方勇飞;吴军;;S100A4,A10在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达及意义[J];第四军医大学学报;2008年07期

7 蒋建平,杨铁城,侯凡凡,朱志刚;人类关节滑膜A型和B型细胞的分离和体外培养[J];第一军医大学学报;2001年01期

8 张泓,王亚东,赖卓胜;硝酸纤维素膜在细胞培养和染色中的应用[J];第一军医大学学报;2003年01期

9 毛伟;李培锋;刘明强;关红;;佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞的体外培养与鉴定[J];动物医学进展;2011年03期

10 孙铁铮,吕厚山;IL-1β和TNF-α诱导RA成纤维样滑膜细胞ICAM-1和VCAM-1表达调控的机制研究[J];中华风湿病学杂志;2005年03期

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1 张莹;方勇飞;王勇;李景怡;黄小鲁;;青藤碱对RA患者成纤维样滑膜细胞体外增殖及凋亡的影响[A];全国中西医结合强直性脊柱炎专题研讨会论文汇编[C];2007年

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1 傅渊源;肩部软组织压痛点的体表定位及其解剖学研究[D];南方医科大学;2011年

2 王建华;类风湿性关节炎的反义VEGF基因治疗实验研究[D];第二军医大学;2001年

3 柏干苹;正常人与关节炎患者血浆、滑膜细胞的差异蛋白质组分析[D];第三军医大学;2006年

4 田静;白藜芦醇对TNF-α诱导的RAFLS抗增殖抗炎作用及其调节PI3K/Akt信号通路的研究[D];中南大学;2010年

5 李森;应力负荷下兔肩袖急性断裂术后腱—骨修复的研究[D];南方医科大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库前10条

1 任洁;三氧化二砷对类风湿性关节炎滑膜细胞凋亡影响的体外研究[D];天津医科大学;2005年

2 包乐媛;四肽化合物CMST1对类风湿性关节炎的治疗作用及其机制探讨[D];天津医科大学;2005年

3 刘伟丽;三氧化二砷诱导RA滑膜细胞凋亡机制的体外研究[D];天津医科大学;2007年

4 张莹;青藤碱对类风湿关节炎患者滑膜细胞凋亡的影响及机制的研究[D];第三军医大学;2007年

5 朱松柏;金雀异黄素对转化生长因子β1诱导大鼠肾系膜细胞结缔组织生长因子表达的影响[D];华中科技大学;2006年

6 胡赟霞;类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞表达survivin的研究[D];天津医科大学;2009年

7 王鹏程;肩袖损伤修复后不同强度应力刺激效果的实验研究[D];南方医科大学;2010年

8 青玉凤;端粒保护蛋白TPP1及POT1在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞表达的研究[D];川北医学院;2010年

9 许丹;鱿鱼皮胶原蛋白肽制备及其对类风湿性关节炎的作用的研究[D];浙江海洋学院;2012年

10 黄静波;肩部电针与康复训练治疗肩撞击综合征的疗效比较[D];黑龙江中医药大学;2013年

【同被引文献】

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1 王伟,张志坚,林建华3,吴秀丽,余良宏,康德智;大鼠骨髓间质干细胞培养扩增及表面标志[J];福建医科大学学报;2005年01期

2 毛娅妮;黄娟;肖伟;陈晓云;;针对小鼠VEGFA基因的siRNA干扰载体的构建和慢病毒包装[J];广州医药;2011年05期

3 张瑞杰;苗向阳;;绵羊抑制素shRNA慢病毒干扰载体的构建与鉴定[J];华北农学报;2011年03期

4 于春鹏;单鸿;姜在波;钱结胜;周斌;吕文天;王劲;庞鹏飞;;大鼠门静脉系影像解剖学研究及穿刺入路的建立[J];当代医学(中国介入放射学);2008年01期

5 常静;雷寒;陈建斌;贾锋鹏;;人间充质干细胞免疫学性质的对比研究[J];临床心血管病杂志;2007年10期

6 白玉贤;刘磊;隋红;魏孝礼;苑珩珩;;miRNA干扰Pokemon基因对大肠癌细胞增殖的影响及机制[J];临床肿瘤学杂志;2011年11期

7 李慧;高春芳;;结缔组织生长因子在肝病中的研究进展[J];现代免疫学;2012年03期

8 叶平;蒋明德;;肝纤维化相关因素的研究现状及进展[J];新医学;2008年12期

9 王宝恩;慢性肝炎的诊断、分级与分期的新动态[J];肝脏病杂志;1995年01期

10 陈江;陈玉满;夏勇;章荣华;蔡德雷;郑云燕;严峻;;大鼠肝纤维化复合模型的建立及动态观察[J];中国卫生检验杂志;2010年03期

中国博士学位论文全文数据库前3条

1 张锦;肝肠钙黏连蛋白（CDH17）在胃癌发生发展中作用的研究及其相关蛋白的筛选[D];武汉大学;2011年

2 董琼珠;骨桥蛋白不同剪切体及单体型在肝癌侵袭转移中的功能与机制研究[D];复旦大学;2009年

3 王岸聪;TLR4对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性影响的实验研究[D];山东大学;2009年

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1 陈晓瑛;ω-3脂肪酸去饱和酶转基因羊的研究[D];山东农业大学;2011年

2 盛鹏程;绵羊Myostatin基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定[D];山东农业大学;2011年

3 刘志达;实验性肝纤维化大鼠肝组织结缔组织生长因子动态变化及其意义[D];河北医科大学;2006年

4 张伟;曲尼司特对实验性COPD大鼠气道重塑的干预作用[D];东南大学;2005年

5 焦洁;细胞因子在尘肺病中的表达及其意义[D];郑州大学;2007年

6 姜晓笛;RNA干扰抑制大鼠肝星状细胞CTGF表达的实验研究[D];中国医科大学;2010年

7 薛美思;携带重组人胰岛素基因的慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的实验研究[D];兰州大学;2010年

8 区永聪;miRNA沉默ATM基因对HepG2在电离辐射后DNA的损伤及修复的影响[D];南方医科大学;2011年

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库前8条

1 黄广林,刘流;体外冲击波在骨科的应用[J];国外医学.骨科学分册;2005年04期

2 邓少林;权毅;潘显明;屈波;荣卫平;张波;廖冬发;;冲击波治疗腰背部软组织疼痛[J];四川医学;2006年07期

3 毛玉瑢,黄东锋,丁建新,徐光青,许燕玲,赵敏;体外冲击波疗法治疗肩关节周围炎的即时效果分析[J];中国临床康复;2003年23期

4 朱宏骞;熊东林;陈葵好;缪映香;张德仁;;高能体外冲击波治疗慢性足底筋膜炎[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年01期

5 安华,李小雯,于长隆;应用体外冲击波治疗末端病的疗效观察[J];中国运动医学杂志;2004年03期

6 贾考田;赵静中;冀俊祥;樊素平;李计东;苏瑞芳;;急性肩峰下滑囊炎38例分析[J];中国现代医生;2007年24期

7 邓廉夫,柴本甫,齐进;损伤性和骨关节炎性滑膜细胞成骨作用的体外研究[J];中华骨科杂志;1997年11期

8 侯凡凡,张训;透析相关性淀粉样变诊断与治疗的进展[J];中华内科杂志;1997年02期

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1 贾考田;赵静中;冀俊祥;樊素平;李计东;苏瑞芳;;急性肩峰下滑囊炎38例分析[J];中国现代医生;2007年24期

2 和宇;;齐刺法治疗肩峰下滑囊炎的临床疗效观察[J];针灸临床杂志;2008年04期

3 黄为民;罗颖;黄丽佳;杨虹;冉春风;;体外冲击波治疗肩峰下滑囊炎的疗效分析[J];齐齐哈尔医学院学报;2009年13期

4 曾永柏;;温针灸配合推拿手法治疗肩峰下滑囊炎31例[J];河南中医;2011年01期

5 张和英;;针刺合刺络拔罐法治疗肩峰下滑囊炎36例[J];贵阳中医学院学报;2008年06期

6 周立武;;燔针劫刺治疗肩峰下滑囊炎临床观察[J];上海针灸杂志;2009年07期

7 许鑫;许易;金志旦;杨威斌;欧阳宏伟;;超声引导下注射疗法治疗运动员肩峰下滑囊炎的临床研究[J];浙江体育科学;2010年05期

8 钱小燕;透刺法为主治疗肩峰下滑囊炎[J];中国针灸;2001年11期

9 邢更彦,刘玉祥,姚建萍,卢兰勤;应用体外冲击波碎石技术治疗肩部软组织慢性损伤性疾病[J];中国疗养医学;1996年03期

10 刘传芳;治疗肩周炎的好办法[J];家庭医学;1996年03期

中国重要会议论文全文数据库前8条

1 刘春山;刘洪强;尚军;高庆霞;赵瑞国;;运用“长圆针”治疗320例“肩峰下滑囊炎”临床观察[A];中国针灸学会经筋诊治专业委员会2010学术年会暨第二届中华经筋医学论坛论文集[C];2010年

2 孙启良;;关于肩关节周围炎的一些新概念[A];第六次全国运动疗法学术会议论文集[C];2002年

3 张盛强;;手法推拿治疗肩周炎[A];第九次全国中西医结合创伤骨科学术大会论文汇编[C];2001年

4 施园;;肩关节周围炎病因的研究进展[A];2011浙江省针灸学会年会暨学术交流会论文汇编[C];2011年

5 杨迪和;潘青春;王文远;;平衡针灸治疗肩周炎246例[A];第四次全国民间传统诊疗技术与验方整理研究学术会论文集[C];2011年

6 王勇;;手法治疗肩周炎与肩部解剖结构的关系[A];第十二次全国推拿学术年会暨推拿手法调治亚健康临床应用及研究进展学习班论文集[C];2011年

7 熊茂林;尹久;;从肩胛带肌着眼对颈椎病肩周炎诊治的再认识[A];第十二次全国推拿学术年会暨推拿手法调治亚健康临床应用及研究进展学习班论文集[C];2011年

8 吴飞;韦英才;梁树勇;;壮医经筋疗法治疗冈上肌肌腱炎疗效观察[A];第十二次全国推拿学术年会暨推拿手法调治亚健康临床应用及研究进展学习班论文集[C];2011年

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1 ;[N];中国中医药报;2004年

2 王展;[N];大众卫生报;2004年

3 刘长信;[N];健康报;2005年

4 本报记者王敬霞;[N];保健时报;2004年

中国硕士学位论文全文数据库前3条

1 眭杰;siRNA双靶向干扰IL-1β/TNF-α治疗肩袖疾病患者肩峰下滑囊炎的实验研究[D];第二军医大学;2012年

2 许峰源;一指刀配合条口透承山治疗肩关节周围炎的疗效观察[D];广州中医药大学;2011年

3 彭宇飞;改良针刀治疗肩周炎的临床研究[D];黑龙江中医药大学;2013年