细胞内MUC1和端粒酶的同时检测及靶向肿瘤细胞的纳米诊疗原位荧光成像

发布时间：2020-05-05 16:17

【摘要】：恶性肿瘤是威胁人类生命健康的重大疾病之一,其发病率逐年上升。因此,恶性肿瘤的早期诊断和治疗是目前人类医学健康面临的最大挑战。一方面,由于肿瘤患者在发病前期并没有异常的症状,这给肿瘤的早期诊断增加了难度。目前的常规诊断方法特异性和灵敏度较低,在肿瘤发生早期较难检测,当确诊时肿瘤细胞已经发生浸润和转移,错过治疗的最佳时机。为了尽早发现和诊断肿瘤,研究者致力于在细胞水平上利用肿瘤标志物的表达来识别和检测肿瘤细胞。另一方面,目前针对肿瘤治疗的主要手段为化学药物治疗,但在临床治疗中普遍存在毒副作用、靶向治疗效果差、肿瘤细胞产生耐药性等问题。因此迫切需要我们发展可控释放的药物载体并靶向输送药物到肿瘤细胞,降低药物的剂量和毒副作用,增强药物的治疗效果,进而提高肿瘤的治疗效果。由于肿瘤标志物的出现可先于细胞或组织形态学和生物学的变化,因此为了实现癌症的早期诊断和治疗,需要寻找特异性强、敏感度高的肿瘤标志物。另外,一种肿瘤可能产生多种标志物,不同的肿瘤或同一肿瘤的不同组织中也可能产生同一种标志物。所以,只检测一种肿瘤标志物,可能会造成假阳性结果。化学药物治疗是癌症治疗的主要手段,但在临床治疗中普遍存在毒副作用。为了降低药物的毒副作用,提高药物疗效,人们不断发展出新的载药系统用于提高药物靶向肿瘤细胞的特异性,并试图解决药物在肿瘤细胞内的可控释放,以实现肿瘤的靶向可控治疗。通常,药物靶向治疗的作用位置主要为肿瘤组织细胞,因而肿瘤组织中特异性表达的标志物成为一类重要的载药系统靶向肿瘤的靶点与控制药物释放的开关。因此在基于肿瘤标志物的靶向治疗中,作为诊断标识、靶向细胞靶点以及药物释放开关的肿瘤标志物的选择至关重要。目前,针对肿瘤标志物的靶向治疗中,细胞靶向位点和药物释放开关的执行者大部分为同一种标志物,通常为细胞膜表面蛋白。这虽然可以有效区分正常组织和癌旁组织,但药物大部分还是释放在细胞外,药物毒副作用和生物利用率还有待改善。选用不同的标志物实现肿瘤细胞的特异性靶向和细胞内药物释放过程的区分可以有效解决这一问题。基于此,我们选取了两种肿瘤标志物:位于细胞膜上的MUC1和位于细胞中的端粒酶来对肿瘤细胞进行检测以及癌症的靶向治疗。因此我们合成了相应的探针。用荧光纳米探针对MUC1和端粒酶同时检测,实现同一肿瘤细胞不同分布的双标志物同时检测以及探针进入细胞的整个过程进行可视化示踪。用载药纳米探针实现多种肿瘤标志物识别触发的纳米诊疗,该载药探针既能对肿瘤细胞进行特异性识别和可控的细胞内药物释放,也能通过分子信标与适配体上的荧光响应以及DOX自身荧光实现靶向诊疗全过程的成像观察。论文的研究内容如下:第一章为绪论,介绍了肿瘤细胞标志物及其检测的研究意义和进展,同时介绍了肿瘤标志物用于靶向肿瘤细胞治疗的意义和研究进展。第二章介绍了一种荧光纳米探针,该荧光纳米探针能够实现同一肿瘤细胞不同分布的双标志物同时检测,并实现整个过程的可视化示踪的纳米探针。该纳米探针以纳米金作为载体,通过Au-S键结合,上面同时连接了对MUC1具有高亲和力的核酸适配体和一个端粒酶特异性识别的DNA杂交体。靶向MUC1的适配体3’端标记有Alexa Fluor 405荧光团,在初始状态下荧光被AuNPs猝灭。端粒酶特异性识别的DNA杂交体一部分为3’端干上具有缺口的分子信标。另外一段较短的端粒酶引物(TSP)序列杂交在该分子信标茎上,作为端粒酶的识别位点。端粒酶不存在时,5’端干上标记FAM荧光团的荧光可以与AuNPs发生FRET效应被猝灭。当探针靠近肿瘤细胞时,会与肿瘤细胞大量表达的MUC1发生作用,探针上MUC1适配体的发夹结构打开,Alexa Fluor 405蓝色荧光恢复,实现对癌细胞的靶向结合和表面MUC1表达检测。在MUC1介导作用下,载药探针更好的进入细胞中,进入细胞后,在细胞内端粒酶作用下,端粒酶引物从3’开始产生重复的端粒序列,使得与之杂交的分子信标结构打开,FAM的绿色荧光恢复,实现了对端粒酶活性的检测。该纳米探针实现同一肿瘤细胞不同分布的双标志物同时检测,消除只针对一种肿瘤标志物进行检测造成的假阳性结果,并且能够实现对纳米探针进入细胞的整个过程进行可视化示踪。第三章介绍了一种载药纳米探针,该载药纳米探针能够对端粒酶与MUC1蛋白的依次响应,可实现同一肿瘤细胞不同分布的双标志物同时检测,同时能够通过细胞膜蛋白MUC1介导来实现载药纳米探针对肿瘤细胞的靶向输送以及胞内端粒酶触发的药物释放及整个过程的可视化示踪。文章中我们选用DOX作为模型药物,DOX是一种常用的化疗药物,通过插入DNA双链结构从而抑制大分子生物合成发挥作用,对多种癌症具有抑制作用。但由于其对心脏、肾脏及神经等正常组织细胞有较严重的毒副作用,且能到达病灶部位发挥抗肿瘤的比例很低,所以用药量大,对患者身体造成严重损害。实现此类药物靶向病灶,精准可控释放无疑具有重要意义。当探针靠近肿瘤细胞时,载药纳米探针上MUC1适配体的与MUC1作用,实现对癌细胞的靶向结合和表面MUC1表达检测。进入细胞后,在细胞内端粒酶作用下,杂交的分子信标结构打开,同时分子灯标上结合的DOX释放出来,实现了对端粒酶活性的检测以及端粒酶调控的药物释放。由于释放出的DOX本身具有荧光发射的性质,整个过程中DOX的释放也可以得到原位观察。由此,我们所设计的基于多种肿瘤标志物识别触发的纳米诊疗探针既能实现对肿瘤细胞的特异性识别和和可控的细胞内药物释放,也能通过分子信标与适配体上的荧光响应以及DOX自身荧光实现靶向诊疗全过程的成像观察。
【图文】：

原理图,适配体,细胞膜蛋白,核酸

山东师范大学硕士毕业论文体识别细胞膜表面的 PTK7 蛋白，引发靶向探针 DNA 序列的构象变化，段 DNA 序列，从而引发一个由 niking 酶切割双链 DNA 进行信号 turn-on 及循环扩增的反应。当液滴流动经过激光照射的位点时，可得到一个反白含量的信号，从而实现细胞膜表面的 PTK7 蛋白的检测。为肿瘤标志物的检测提供了一种方法。

序列,EGFR基因,荧光探针,石墨

山东师范大学硕士毕业论文NA 突变荧光检在肿瘤的发生过程中，往往伴随着 DNA 的突变存在，可以说 DNA 的突瘤的发生有着很大的关系。因此对于 DNA 突变的检测有助于癌症的早期Dong-Eun Kim 课题组[27]发展了一种以 DNA 荧光探针和石墨烯为基础的CR 方法对 EGFR 基因的第 19 个突变碱基进行检测（图 1-2）。将荧光标NA 探针被设计成完全与 EGFR 基因互补的序列，而与正常型的基因不能互补。在 PCR 过程中，检测到 EGFR 基因时，荧光标记的 DNA 探针能出游离的 FAM 荧光基团，而检测到正常型基因时，FAM 荧光基团仍然 DNA 相连，随后在加入石墨烯后，由于石墨烯的吸附作用，将于 DNA DNA 吸附，导致荧光集团猝灭，而游离地 FAM 荧光集团不会被吸附。光信号来达到检测突变 EGFR 基因的目的。
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730;O657.3

【参考文献】