肿瘤微环境对滤泡调节性T细胞的作用及其机制的研究

发布时间：2017-04-15 13:17

  本文关键词：肿瘤微环境对滤泡调节性T细胞的作用及其机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:利用Lewis肺癌移植瘤小鼠模型,研究在肺腺癌发病进程中滤泡调节性T细胞(follicular regulatory T cells,Tfr)比例的变化,并分析其与疾病状态间的关系;在体外以Lewis肺癌细胞培养上清模拟肿瘤微环境,研究肿瘤微环境对Tfr细胞分化的影响,并探讨IL-6在此过程中发挥的作用。方法:(1)利用皮下注射Lewis肺癌细胞的方式构建肺癌移植瘤小鼠模型。在肺腺癌发病进程中,通过流式细胞术检测小鼠腹壁引流淋巴结和肿瘤组织中Treg细胞、Tfr细胞和Tfh细胞的比例,并分析Treg/Tfr细胞比值以及Tfh/Tfr细胞比值的变化情况。(2)免疫磁珠法分选正常小鼠脾脏来源的CD4+CD25+T细胞,与Lewis肺癌细胞进行transwell共培养,以CD4+CD25+T细胞单独培养作为对照。通过流式细胞术检测CD4+CD25+T细胞CXCR5和Bcl-6的表达情况,分析两种细胞间可能存在的作用方式。(3)用无血清RPMI 1640培养基分别将相同数量的鼠源性Lewis肺癌细胞、CT26结肠癌细胞以及MFC胃癌细胞在相同条件下进行培养。收集细胞培养上清,ELISA检测不同肿瘤细胞培养上清中IL-6的表达水平。(4)免疫磁珠法分选正常小鼠脾脏来源的CD4+CD25+T细胞,每孔加入1/4总体积的Lewis肺癌细胞培养上清。其中实验组Lewis肺癌细胞培养上清预先加入抗IL-6中和性抗体处理,用以抑制IL-6的生物学活性。对照组Lewis肺癌细胞培养上清不做任何预处理。培养72h后采用流式细胞术检测CD4+CD25+T细胞CXCR5和Bcl-6的表达情况(5)免疫磁珠法分选正常小鼠脾脏来源的CD4+CD25+T细胞,实验组加入rm IL-6(10ng/ml)。培养72h后采用流式细胞术检测CD4+CD25+T细胞CXCR5、Bcl-6以及Foxp3的表达情况。(6)肺癌移植瘤小鼠尾部静脉注射抗IL-6中和性抗体,以等体积PBS溶液作为对照,观察肿瘤生长情况。通过流式细胞术检测小鼠腹壁引流淋巴结和肿瘤组织中Treg和Tfr细胞的比例,分析Treg/Tfr细胞比值的变化情况。结果:(1)随着癌症的发展进程,荷瘤小鼠腹壁引流淋巴结中Tfr细胞的比例不断上升,且与野生型小鼠相比差异明显(P0.01)。肿瘤组织中Tfr细胞比例在第14天时上升显著,与第7天相比差异有明显统计学意义(P0.01),在第21天时细胞比例下降。荷瘤小鼠淋巴结和肿瘤组织中Treg/Tfr细胞比值较野生型小鼠均明显下降(P0.01)。荷瘤小鼠淋巴结中Tfh/Tfr细胞比值较野生型小鼠下降(P0.05)。该结果提示:肿瘤微环境可能促进Tfr细胞的分化,并且Tfh细胞与Tfr细胞比例失衡。(2)与对照组相比,CD4+CD25+T与Lewis肺癌细胞Transwell共培养组中CD4+CD25+T细胞CXCR5和Bcl-6的表达水平均出现明显上调。该结果提示:Lewis肺癌细胞可以通过间接作用的方式诱导CD4+CD25+T细胞表达CXCR5和Bcl-6,以促进CD4+CD25+T细胞向Tfr细胞分化。(3)Lewis肺癌细胞培养上清中IL-6的表达水平最高(276.3±29.9 pg/ml),而CT26细胞和MFC细胞培养上清中IL-6的表达水平分别仅为(77.38±13.86pg/ml)和(145.8±32.6 pg/ml)。该结果说明:Lewis肺癌细胞具备大量分泌IL-6的能力,即以Lewis肺癌细胞培养上清模拟的肿瘤微环境中存在着高水平IL-6。(4)抗IL-6中和性抗体处理组CD4+CD25+T细胞CXCR5的表达水平与对照组相比明显下降(P0.01),而Bcl-6的表达则无明显变化。该结果提示:以Lewis肺癌细胞培养上清模拟的肿瘤微环境能够促进Tfr细胞分化,并且CXCR5表达的上调与细胞培养上清中高水平的IL-6有关。(5)加入rm IL-6(10ng/ml)实验组中CD4+CD25+T细胞CXCR5的表达水平与对照组相比明显增加(P0.01),而Bcl-6和Foxp3的表达则无明显变化。该结果提示:IL-6能够促进CD4+CD25+T细胞上CXCR5的表达。(6)与PBS对照组相比,注射抗IL-6中和性抗体的荷瘤小鼠肿瘤生长速度减慢,淋巴结和脾脏肿大程度减轻。腹壁引流淋巴结和肿瘤组织中Tfr细胞比例下降(P0.05),Treg/Tfr细胞比值增大(P0.05)。该结果提示:肺癌移植瘤小鼠体内IL-6的缺失可能会影响Tfr细胞的分化。结论:(1)随着癌症的发展进程,荷瘤小鼠体内Tfr细胞的比例增加,Tfh细胞与Tfr细胞比例失衡。(2)肿瘤微环境促进CD4+CD25+T细胞向Tfr细胞分化。(3)IL-6促进CD4+CD25+T细胞CXCR5的表达。
【关键词】：滤泡调节性T细胞 肿瘤微环境 分化 白细胞介素-6
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 绪论15-27
• 1.1 Treg细胞15-16
• 1.1.1 Treg细胞的概述15
• 1.1.2 Treg细胞的功能15
• 1.1.3 Treg细胞与肿瘤的相互作用15-16
• 1.2 Tfr细胞16-21
• 1.2.1 Tfr细胞的发现16
• 1.2.2 Tfr细胞的表型16-17
• 1.2.3 Tfr细胞的来源17-18
• 1.2.4 Tfr细胞的分化18-20
• 1.2.5 Tfr细胞的功能20-21
• 1.3 Tfh细胞21-24
• 1.3.1 Tfh细胞的概述21-22
• 1.3.2 Tfh细胞的分化22
• 1.3.3 Tfh细胞的功能22-23
• 1.3.4 Tfh细胞与肿瘤的相互作用23-24
• 1.5 本研究的目的、方法、设计及意义24-27
• 1.5.1 研究目的24
• 1.5.2 研究方法24
• 1.5.3 研究方案设计24-26
• 1.5.4 研究意义26-27
• 第二章 肺癌移植瘤小鼠体内Tfr细胞的变化情况27-38
• 2.1 实验仪器和材料27-29
• 2.1.1 实验仪器27-28
• 2.1.2 实验材料28
• 2.1.3 实验试剂28-29
• 2.1.4 实验动物29
• 2.1.5 主要溶液配制29
• 2.2 实验方法29-31
• 2.2.1 Lewis肺癌移植瘤小鼠模型的建立29
• 2.2.2 小鼠淋巴结细胞的分离29-30
• 2.2.3 小鼠肿瘤组织的消化和分离30
• 2.2.4 FCM检测小鼠淋巴结和肿瘤组织中Treg细胞、Tfr细胞、Tfh细胞的比例30-31
• 2.2.5 图像与统计学分析31
• 2.3 实验结果31-36
• 2.3.1 各组小鼠淋巴结和肿瘤组织中Treg细胞比例的变化31-32
• 2.3.2 各组小鼠淋巴结和肿瘤组织中Tfr细胞比例的变化32-34
• 2.3.3 各组小鼠淋巴结和肿瘤组织中Treg/Tfr细胞比值的变化34
• 2.3.4 各组小鼠淋巴结中Tfh细胞比例的变化34-35
• 2.3.5 各组小鼠淋巴结中Tfh/Tfr细胞比值的变化35-36
• 2.4 讨论36-38
• 第三章 Tfr细胞体外分化的初步研究38-52
• 3.1 实验仪器和材料38-40
• 3.1.1 实验仪器38-39
• 3.1.2 实验材料39
• 3.1.3 实验试剂39-40
• 3.1.4 实验动物40
• 3.1.5 主要溶液配制40
• 3.2 实验方法40-44
• 3.2.1 免疫磁珠法分离小鼠脾脏CD4~+CD25~+T细胞40-42
• 3.2.2 CD4~+CD25~+T细胞与Lewis肺癌细胞Transwell共培养42-43
• 3.2.3 ELISA检测肿瘤细胞培养上清中IL-6 的表达水平43
• 3.2.4 Lewis肺癌细胞培养上清中IL-6 对Tfr细胞分化的影响43-44
• 3.2.5 rmIL-6 对Tfr细胞分化的影响44
• 3.2.6 图像与统计学分析44
• 3.3 实验结果44-50
• 3.3.1 免疫磁珠法分选CD4~+CD25~+T细胞的纯度鉴定44-45
• 3.3.2 Transwell共培养检测Lewis肺癌细胞对CD4~+CD25~+T细胞的影响45-46
• 3.3.3 ELISA检测不同肿瘤细胞培养上清中IL-6 的表达水平46-47
• 3.3.4 Lewis肺癌细胞培养上清中IL-6 对Tfr细胞分化的影响47-48
• 3.3.5 IL-6 促进CD4~+CD25~+T细胞上CXCR5的表达48-50
• 3.4 讨论50-52
• 第四章 IL-6 对肺癌移植瘤小鼠体内Tfr细胞的影响52-63
• 4.1 实验仪器和材料52-54
• 4.1.1 实验仪器52-53
• 4.1.2 实验材料53
• 4.1.3 实验试剂53
• 4.1.4 实验动物53-54
• 4.1.5 主要溶液配制54
• 4.2 实验方法54-56
• 4.2.1 Lewis肺癌移植瘤小鼠模型的建立与分组处理54
• 4.2.2 小鼠肿瘤生长变化曲线的测量54-55
• 4.2.3 小鼠淋巴结细胞的分离55
• 4.2.4 小鼠肿瘤组织的消化和分离55
• 4.2.5 FCM检测小鼠淋巴结和肿瘤组织中Treg细胞和Tfr细胞的比例55-56
• 4.2.6 图像与统计学分析56
• 4.3 实验结果56-62
• 4.3.1 小鼠肿瘤组织的体积及重量56-57
• 4.3.2 小鼠淋巴结、脾脏及肿瘤组织的大体观察57-58
• 4.3.3 不同处理组小鼠淋巴结和肿瘤组织中Treg细胞比例的变化58-60
• 4.3.4 不同处理组小鼠淋巴结和肿瘤组织中Tfr细胞比例的变化60-61
• 4.3.5 不同处理组小鼠淋巴结和肿瘤组织中Treg/Tfr细胞比值的变化61-62
• 4.4 讨论62-63
• 结论63-64
• 参考文献64-73
• 致谢73-74
• 攻读硕士学位期间发表的文章及科研成果74

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  本文关键词：肿瘤微环境对滤泡调节性T细胞的作用及其机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

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