热休克蛋白gp96 3’UTR作为ceRNA通过miR-642a调控DOHH表达的研究

发布时间：2017-04-29 01:04

  本文关键词：热休克蛋白gp96 3’UTR作为ceRNA通过miR-642a调控DOHH表达的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：热休克蛋白gp96 (glycoprotein 96),也称作GRP94, HSP90b1, TRA-1, ERp99,作为内质网中最主要的蛋白之一,是细胞质热休克蛋白HSP90的同源蛋白。热休克蛋白gp96主要功能为作为分子伴侣帮助新生蛋白的折叠和变性蛋白的降解。我们和他人的研究均发现热休克蛋白gp96在肝癌、乳腺癌、骨髓瘤等多种肿瘤高表达,同时已经查明热休克蛋白gp96可以与Wnt共受体LRP6、胰岛素样生长因子、整合素、HER2、uPAR等相互作用,它对于维持这些肿瘤蛋白的稳定性和功能发挥重要调节作用,然而热休克蛋白gp96在调节肿瘤发生、发展的作用机制仍需进一步深入研究。MicroRNAs (miRNAs)是一类长度约为22个核苷酸而且进化上非常保守的非编码小RNA。通常情况下,miRNA会与靶mRNA的3'-UTR不完全配对结合从而导致靶基因的翻译抑制或降解。它参与了发育、感染、免疫反应和肿瘤转移等多种生物学过程。近来的研究发现一些具有相同miRNA应答元件(miRNA response element, MRE)的长链非编码RNA、假基因编码RNA、环形RNA(circular RNA,circRNA)以及部分mRNA.甚至病毒mRNA可作为“海绵”吸附、隔离与其相互作用的miRNA,从而抑制：miRNA的功能,进而导致miRNA其它靶基因的表达上调,实现对niRNA靶RNA的丰度或翻译活性的调控,从而影响细胞的功能。本文首先通过生物信息学技术预测热休克蛋白gp96 3'UTR上miRNA潜在作用靶点,通过比较分析我们选择niR-642a进一步研究。利用双荧光素酶报告基因活性检测和免疫印迹分析,我们发现miR-642a可以特异性靶向热休克蛋白gp96 3'UTR。根据文献报道,在前列腺癌细胞中miR-642a可以调控DOHH的表达细胞增殖。为了查明热休克蛋白gp96 3'UTR对DOHH表达的影响,我们在人肝癌Huh7细胞系中转染了野生型和miR-642a结合位点突变的gp96 3'UTR的萤光素酶报告基因质粒,并通过实时实时定量PCR、RNA干扰和免疫印迹分析miR-642a和DOHH的mRNA及其蛋白水平。实验结果发现在人肝癌Huh7细胞系中过表达野生型gp96 3'UTR显著下调miR-642a的水平并同时上调miR-642a靶基因DOHH的表达。为进一步探讨热休克蛋白gp96 3'UTR是否通过miR-642a调节DOHH的表达,我们在人肝癌Huh7细胞系转染了人工合成miR-642a的反义抑制剂,结果发现在干扰gp96表达的同时转染miR-642a抑制剂,gp96则失去对DOHH的调节作用,说明gp96 3'UTR对DOHH的调控是依赖于miR-642a。同时实验还发现DOHH并不影响gp96的表达。综上所述,我们发现热休克蛋白gp96 3'UTR作为ceRNA正向调控DOHH的表达,这种调控作用依赖于miR-642a、不依赖于gp96的蛋白表达。我们实验室以及其他人的研究均发现,gp96的mRNA和蛋白表达在乙肝慢性感染显著中上调,gp96的表达水平与慢性乙肝疾病进展有着十分密切相关,gp96在肝脏肿瘤中的过量表达与肿瘤的恶性程度和不良预后呈现显著相关性。目前对gp96在肿瘤发生发展中的作用机制全部集中在其作为分子伴侣蛋白的功能,并且我们的研究发现gp96 mRNA的3’UTR作为ceRNA可上调肿瘤基因DOHH的表达,这为深入研究gp96如何参与调节肝癌等肿瘤的发生发展提供了一种新思路,为全面分析gp96促进肿瘤细胞生长的机制以及靶向治疗提供理论依据。
【关键词】：热休克蛋白gp96 microRNA 脱氧羟腐氨酸羟化酶 竞争性RNA 细胞增殖
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;R730.2
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 英文缩写词表8-11
• 第一章 引言11-27
• 1 热休克蛋白gp96的结构与功能11-18
• 1.1 热休克蛋白简介11-12
• 1.2 热休克蛋白gp96概述12-18
• 2 MicroRNA的研究进展18-27
• 2.1 MicroRNA的发现及简介18-19
• 2.2 MicroRNA的生物合成19-21
• 2.3 MicroRNAs分子作用机制21-22
• 2.4 MicroRNA的靶点预测22-24
• 2.5 竞争性内源RNA(ceRNA)假说24-27
• 第二章 gp96 3'UTR作为ceRNA通过miR-642a调控DOHH的表达27-57
• 1 实验材料27-31
• 1.1 细胞系、质粒和菌株27
• 1.2 引物和siRNA27-28
• 1.3 试剂与抗体28
• 1.4 主要仪器28-29
• 1.5 溶液配制29-31
• 2 实验方法31-47
• 2.1 质粒的构建31-35
• 2.2 质粒的定点突变35-36
• 2.3 细胞传代、冻存、复苏和转染36-38
• 2.4 细胞内总RNA的提取38
• 2.5 RNA的反转录38-40
• 2.6 实时定量PCR40-41
• 2.7 Western bolting41-44
• 2.8 双荧光素酶报告基因检测44-45
• 2.9 统计学分析45-47
• 3 实验结果47-55
• 3.1 热休克蛋白gp96 pcDNA3.1表达载体的构建与鉴定47-48
• 3.2 热休克蛋白gp96 3'UTR含有miR-642a的靶点48-50
• 3.3 热休克蛋白gp96 3'UTR上调DOHH的表达50-52
• 3.4 热休克蛋白gp96通过miR-642a参与调控DOHH的表达52-53
• 3.5 DOHH不影响的热休克蛋白gp96表达53-55
• 4 讨论55-57
• 参考文献57-67
• 作者简历和发表文章67-69
• 致谢69

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