剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2对UVB的响应及其功能研究

发布时间：2021-11-02 20:21

　　过量紫外线照射是导致皮肤癌发生的重要原因,其中的发病机理一直是生物医学研究的重点方向。近年来,对于UV照射引起的基因可变剪接的研究越来越得到重视,因为UV照射应激下表达的基因变异体对于肿瘤的形成有重要促进作用。其中,mdm2基因作为一种致癌基因,在多种肿瘤中表现出高水平表达,同时,在肿瘤细胞中发现了mdm2基因的多种变异体,这些变异体的出现对于肿瘤的发生有重要的促进作用。并且,有研究证明UVB照射可以有效诱导mdm2基因的可变剪接过程,但是具体的调控机制仍然不清楚。剪接因子是一类调控基因可变剪接的重要蛋白,它们可以通过调节基因的可变剪接过程产生不同的基因变异体,从而导致细胞生理过程的改变。但是剪接因子是否调控UVB照射引起的mdm2可变剪接过程还没有研究报道。本论文以hnRNP Al和ASF/SF2两个重要的剪接因子为研究对象,用细胞分子生物学方法检测了剪接因子hnRNP Al和ASF/SF2在UVB引起的mdm2基因可变剪接过程中的调节作用。另外,剪接因子hnRNP Al和ASF/SF2在多种类型的肿瘤中都表现出高表达,被认为是一种促进癌症的因子,研究两因子对于UVB照射的响应及细胞... 

【文章来源】：重庆大学重庆市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：134 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
ABSTRACT
主要缩略词
1 绪论
    1.1 问题的提出和意义
    1.2 国内外研究现状
        1.2.1 UV照射与基因的可变剪接
        1.2.2 UV照射与细胞信号通路激活
        1.2.3 UV照射与细胞自噬
    1.3 本研究的目的及研究内容
        1.3.1 本研究的目的
        1.3.2 本研究的主要内容
        1.3.3 本研究的创新点
2 UVB引起的mdm2的可变剪接
    2.1 前言
    2.2 实验仪器、材料与试剂
        2.2.1 实验仪器
        2.2.2 实验材料与试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 细胞培养、冻存及复苏
        2.3.2 UVB照射
        2.3.3 总RNA的提取及检测
        2.3.4 RNA反转录
        2.3.5 RT-PCR检测基因表达
        2.3.6 质粒构建(pcDNA3.1 mdm2-FL and mdm2B)
        2.3.7 质粒瞬时转染
        2.3.8 CCK-8检测细胞存活率
    2.4 实验结果
        2.4.1 UVB照射导致了mdm2基因的可变剪接
        2.4.2 pcDNA3.1/mdm2-FL和pcDNA3.1/mdm2 B质粒的构建
        2.4.3 mdm2-FL和mdm2 B对细胞在UVB照射后存活率的影响
    2.5 讨论
    2.6 本章小结
3 剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2在UVB引起的mdm2可变剪接过程中的调控作用
    3.1 前言
    3.2 实验仪器、材料与试剂
        3.2.1 实验仪器
        3.2.2 材料与试剂
    3.3 实验方法
        3.3.1 UVB照射
        3.3.2 Western blot
        3.3.3 瞬时转染重组质粒及siRNA
        3.3.4 总RNA提取及检测
        3.3.5 RNA反转录
        3.3.6 RIP-RT-PCR (RNA沉淀Real-time PCR检测)
    3.4 实验结果
        3.4.1 UVB照射后HaCaT细胞中剪接因子hnRNPA1和ASF/SF2表达增加
        3.4.2 通过质粒瞬时转染过表达和用siRNA沉默hnRNP A1和ASF/SF2在HaCaT细胞中的表达
        3.4.3 hnRNP A1和ASF/SF2的表达对于mdm2可变剪接的影响
        3.4.4 hnRNP A1可以调控UVB照射引起的mdm2的可变剪接
    3.5 讨论
    3.6 本章小结
4 剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2对UVB剂量和时间的响应以及细胞定位的改变
    4.1 前言
    4.2 实验仪器、材料与试剂
        4.2.1 实验仪器
        4.2.2 实验材料与试剂
    4.3 实验方法
        4.3.1 UVB照射
        4.3.2 Western blot
        4.3.3 免疫荧光
        4.3.4 细胞质细胞核蛋白分离
        4.3.5 siRNA转染
        4.3.6 细胞存活率的测定
    4.4 实验结果
        4.4.1 UVB照射剂量及时间对hnRNP A1与ASF/SF2表达的影响
        4.4.2 免疫荧光检测UVB照射后hnRNP A1与ASF/SF2的细胞定位
        4.4.3 Western blot检测UVB照射后hnRNP A1与ASF/SF2在细胞质和细胞核中的表达
        4.4.4 沉默hnRNP A1与ASF/SF2的表达对HaCaT细胞在UVB照射后的细胞存活率的影响
    4.5 讨论
    4.6 本章小结
5 ROS、p53以及NF-к B和Akt通路对于剪接因子hnRNP A1和ASF/SF2表达的影响
    5.1 前言
        5.1.1 ROS,p53与UVB照射
        5.1.2 NF-κB,Akt信号通路与UVB照射
    5.2 实验仪器、材料与试剂
        5.2.1 实验仪器
        5.2.2 实验材料与试剂
    5.3 实验方法
        5.3.1 细胞培养、冻存及复苏
        5.3.2 UVB照射
        5.3.3 药物处理
        5.3.4 pcDNA 6.0/p53质粒转染H1299细胞
        5.3.5 Western blot
    5.4 实验结果
        5.4.1 ROS抑制hnRNPA1和ASF/SF2的蛋白表达
        5.4.2 p53抑制hnRNPA1和ASF/SF2的蛋白表达
        5.4.3 NF-κB信号通路与剪接因子的表达
        5.4.4 Akt信号通路与剪接因子的表达
    5.5 讨论
    5.6 本章小结
6 剪接因子hnRNP A1、ASF/SF2与UVB引起的细胞自噬
    6.1 前言
        6.1.1 细胞自噬
        6.1.2 慢病毒系统
    6.2 实验仪器、材料与试剂
        6.2.1 实验仪器
        6.2.2 实验材料与试剂
    6.3 实验方法
        6.3.1 UVB照射
        6.3.2 Western blot
        6.3.3 pcDNA3.1-EGFP-LC3B质粒的构建
        6.3.4 EGFP-LC3B HaCaT稳定细胞株的构建
        6.3.5 药物及饥饿处理
        6.3.6 质粒的瞬时转染
    6.4 实验结果
        6.4.1 UVB可以导致细胞自噬的发生
        6.4.2 LC3B基因的扩增及pcDNA3.1-EGFP-LC3B质粒的构建
        6.4.3 EGFP-LC3B HaCaT稳定细胞株的构建
        6.4.4 通过EGFP-LC3B puncta的形成检测UVB处理导致细胞自噬的发生
        6.4.5 饥饿和雷帕霉素引起细胞自噬发生
        6.4.6 hnRNPA1和ASF/SF2对细胞自噬的影响
    6.5 讨论
    6.6 本章小结
7 主要结论与未来工作展望
    7.1 主要结论
    7.2 未来工作展望
致谢
参考文献
附录 作者在攻读博士学位期间科研及发表论文、专利情况



本文编号：3472327