鉴定结肠癌新抗原的斑马鱼模型的建立与应用
发布时间：2022-01-06 19:55
结直肠癌致死率和发病率呈现逐年上升趋势,是人类第三大恶性肿瘤。除了传统的手术及放化疗手段,基于肿瘤新生抗原的个体化肿瘤疫苗是新兴的抗肿瘤疗法。肿瘤新抗原源自体细胞突变,由于其在正常组织中不表达而具有肿瘤特异性。目前国内外针对结肠癌新抗原的研究相对较少。相比当前癌症研究的临床前免疫缺陷小鼠模型,斑马鱼（Danio rerio）具有与人类基因组高同源、短周期、高通量、体内动态可视、发育前期无适应性免疫、以及低成本等优势,逐渐发展成另一相对快速且具有较高成本效益的人类癌症体内模型。据此,本研究旨在构建简便有效的筛选及鉴定结肠癌新抗原的新平台,并期望应用该模型获得候选靶点抗原。我们依赖于斑马鱼异种移植的能力来揭示效靶细胞在其体内的免疫原性及杀伤活性,因此我们（1）构建斑马鱼移植瘤模型,将CM-Dil标记的T2-A24细胞显微注射入受精后2天（days post fertilization,dpf）的斑马鱼体内,培养4天,发现T2-A24细胞具有在斑马鱼体内增殖的能力;（2）为了确定合适的效靶细胞比例,显微注射CM-Dil标记的不同数量外周血单核细胞（peripheral blood monon...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
T2-A24模式靶细胞在斑马鱼体内呈现增殖潜能CM-Dil染料标记T2-A24细胞，显微注射100个细胞到2dpf斑马鱼胚胎卵黄囊中
浙江大学硕士学位论文3结果18图3.2PBMC可在斑马鱼体内稳定存在一周左右CM-Dil染料标记PBMC细胞，分别显微注射1000/500/250个细胞到2dpf斑马鱼胚胎卵黄囊中。在注射后0/2/4/6/8天内，每天统计胚胎的存活率，并随机选取其中的胚胎，将其置于荧光显微镜下观察。（A）斑马鱼体内异种移植细胞0/2/4/6/8天，具有代表性的斑马鱼模型的荧光图，放大倍数均为40×；（B）移植0/2/4/6/8天，各组别斑马鱼胚胎的存活率。3.3构建效靶细胞同时注射-斑马鱼移植瘤免疫干预模型3.3.1AKF9体外免疫原性验证为了建立构建斑马鱼移植瘤免疫干预模型的方法，我们选择了文献中已报道的能与HLA-A*24:02分子强结合的多肽AKF9（AYLEAIHKF）[41]。我们利用T2-binding实验检测AKF9与HLA-A*24:02分子的结合力，ELISpot实验检测单个细胞水平分泌IFN-γ的CTL数。实验结果显示，AKF9处理组FI值大于1.5，说明AKF9与HLA-A*24:02有强结合力（如图3.3A），与文献报道一致。体外诱导T细胞活化实验进一步检测AKF9的免疫原性，发现AKF9处理组斑点数远大于Blank组，且P值小于0.05，有统计学意义（如图3.3B-C）。根据以上结果，我们认为AKF9如相关文献报道，具有一定的体外免疫原性，因此可以选为我们建模方法中的阳性肽。
浙江大学硕士学位论文3结果19图3.3AKF9体外免疫原性验证T2-A24细胞与AKF9共孵育16-18小时。PMBC负载AKF9，添加IL-2后培养12天，分别收集细胞。（A）对于收集的T2-A24细胞，加入适量的Anti-HLA-A24(Human)mAb-FITC抗体孵育，PBS洗涤后上流式细胞仪检测AKF9与HLA-A*24:02分子的结合力。其中CEF20为阴性对照，Blank为空白对照。FI为荧光系数，若FI>1.5，则待测肽与HLA-A分子具有强结合力；1.0<FI<1.5，中等结合力；0.5<FI<1，弱结合力；FI<0.5，无结合力；（B）对于收集的T2-A24和PBMC细胞，用ELISpot试剂盒检测负载抗原的DC诱导的CTL数。其中Blank为阴性对照，Medium为空白对照；（C）对（B）的定量统计分析，SFC/106PBMCs表示为反应强度。C中结果表示为Mean±SEM，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001。
本文编号：3573071
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
T2-A24模式靶细胞在斑马鱼体内呈现增殖潜能CM-Dil染料标记T2-A24细胞，显微注射100个细胞到2dpf斑马鱼胚胎卵黄囊中
浙江大学硕士学位论文3结果18图3.2PBMC可在斑马鱼体内稳定存在一周左右CM-Dil染料标记PBMC细胞，分别显微注射1000/500/250个细胞到2dpf斑马鱼胚胎卵黄囊中。在注射后0/2/4/6/8天内，每天统计胚胎的存活率，并随机选取其中的胚胎，将其置于荧光显微镜下观察。（A）斑马鱼体内异种移植细胞0/2/4/6/8天，具有代表性的斑马鱼模型的荧光图，放大倍数均为40×；（B）移植0/2/4/6/8天，各组别斑马鱼胚胎的存活率。3.3构建效靶细胞同时注射-斑马鱼移植瘤免疫干预模型3.3.1AKF9体外免疫原性验证为了建立构建斑马鱼移植瘤免疫干预模型的方法，我们选择了文献中已报道的能与HLA-A*24:02分子强结合的多肽AKF9（AYLEAIHKF）[41]。我们利用T2-binding实验检测AKF9与HLA-A*24:02分子的结合力，ELISpot实验检测单个细胞水平分泌IFN-γ的CTL数。实验结果显示，AKF9处理组FI值大于1.5，说明AKF9与HLA-A*24:02有强结合力（如图3.3A），与文献报道一致。体外诱导T细胞活化实验进一步检测AKF9的免疫原性，发现AKF9处理组斑点数远大于Blank组，且P值小于0.05，有统计学意义（如图3.3B-C）。根据以上结果，我们认为AKF9如相关文献报道，具有一定的体外免疫原性，因此可以选为我们建模方法中的阳性肽。
浙江大学硕士学位论文3结果19图3.3AKF9体外免疫原性验证T2-A24细胞与AKF9共孵育16-18小时。PMBC负载AKF9，添加IL-2后培养12天，分别收集细胞。（A）对于收集的T2-A24细胞，加入适量的Anti-HLA-A24(Human)mAb-FITC抗体孵育，PBS洗涤后上流式细胞仪检测AKF9与HLA-A*24:02分子的结合力。其中CEF20为阴性对照，Blank为空白对照。FI为荧光系数，若FI>1.5，则待测肽与HLA-A分子具有强结合力；1.0<FI<1.5，中等结合力；0.5<FI<1，弱结合力；FI<0.5，无结合力；（B）对于收集的T2-A24和PBMC细胞，用ELISpot试剂盒检测负载抗原的DC诱导的CTL数。其中Blank为阴性对照，Medium为空白对照；（C）对（B）的定量统计分析，SFC/106PBMCs表示为反应强度。C中结果表示为Mean±SEM，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001。
本文编号：3573071
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