PPARα/Bcl2信号诱导细胞凋亡

发布时间：2022-01-07 13:00

　　癌症已成为当前人类死亡的主要疾病,而全球癌症发病率与死亡率呈持续上升趋势,世界卫生组织发布的报告显示2012年全球有1400万人被诊断患癌,罹患人数最多的3大癌症分别是肺癌（180万）、乳癌（170万）、大肠癌（140万）。每年全球有420万人死于癌症。在2012年,全球新增癌症病例中超过50%的患者,来自亚洲,而他们中的大部分发生在中国。此外,中国也是新增肝癌病例的主要国家,由乙型肝炎引起的肝癌中国排在全球首位。因此,深入揭示癌症发病机制显得越来越重要而紧迫,这将有助于开发更多而有效的癌症治疗药物。PPARα属于过氧化物酶体增殖剂激活受体（PPARs）家族中的一员,它在调节细胞增殖、凋亡、肿瘤发生等方面发挥重要作用。恶性肿瘤的主要特征是细胞异常增生并抑制细胞凋亡。Bcl2家族蛋白包括促进细胞存活蛋白（Bcl2,Bcl-xl,Mcl-1）及促进细胞凋亡蛋白（Bax,Bad,Bim）。基于此,PPARα与抗凋亡Bcl2家族蛋白相关性机制依然不清楚。本研究发现:PPARα具有E3泛素化连接酶新功能并诱导底物Bcl2蛋白泛素化、降解,从而增强化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡并降低其存活率。显著性发现... 

【文章来源】：江苏大学江苏省

【文章页数】：83 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章绪论
    1.1 过氧化物酶体增殖剂激活受体 Α（PPARΑ）
        1.1.1 PPARα 概论
        1.1.2 PPARα 和肿瘤
    1.2 E3泛素化连接酶
        1.2.1 E3泛素化连接酶概论
        1.2.2 指环结构域（RING）的一般特征
        1.2.3 大多数指环结构域蛋白调节泛素的转移
        1.2.4 鉴定E3泛素化连接酶是非常重要的
        1.2.5 鉴定出E3泛素化连接酶的底物是非常重要的
    1.3 B淋巴细胞瘤-2 基因（BCL2）
        1.3.1 Bcl2概论
        1.3.2 Bcl2和肿瘤
    1.4 本研究的意义
    1.5 主要研究内容和技术路线
        1.5.1 主要研究内容
        1.5.2 技术路线
第二章 PPARα 降低Bcl2蛋白水平
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验细胞系以及质粒
        2.1.2 实验仪器及实验耗材
        2.1.3 主要实验试剂及其配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 质粒扩增和提取
        2.2.2 细胞培养
        2.2.3 细胞转染
        2.2.4 细胞加药物处理
        2.2.5 细胞总蛋白提取
        2.2.6 细胞质细胞核分离提取
        2.2.7 细胞蛋白浓度的测定
        2.2.8 蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测目标蛋白含量变化
        2.2.9PPARα 对Bcl2基因水平的影响
    2.3 实验结果与分析
        2.3.1 PPARα 在不同细胞系中的表达
        2.3.2 PPARα 基因沉默增加Bcl2蛋白水平
        2.3.3 PPARα 基因沉默后，Bcl2的半衰期显著延长
        2.3.4 过表达PPARα 显著降低内源性和外源性Bcl2蛋白水平
        2.3.5 PARs家族中只有PPARα 降低Bcl2蛋白水平
        2.3.6 PARα 对Bcl2的基因表达无影响
        2.3.7 PPARα 依赖蛋白酶体信号降解Bcl2蛋白
        2.3.8 PPARα 诱导Bcl2降解，缩短其半衰期
        2.3.9 PPARα 激活剂对Bcl2蛋白水平基本无影响
    2.4 本章小结
第三章 PPARα 作为泛素化连接酶诱导Bcl2泛素化降解
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验细胞系和质粒
        3.1.2 实验仪器
        3.1.3 主要实验试剂及其配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 质粒扩增和提取
        3.2.2 构建PPARα/C102A点突变质粒
        3.2.3 细胞培养与处理
        3.2.4 细胞转染
        3.2.5 细胞加药物处理
        3.2.6 细胞总蛋白提取
        3.2.7 变性免疫共沉淀
        3.2.8 LC/MS/MS分析PPARα 诱导Bcl2泛素化位点
        3.2.9 体外泛素化
    3.3 实验结果与分析
        3.3.1 PPARα 显著增加内源性和外源性Bcl2的泛素化
        3.3.2 PPARα 沉默抑制Bcl2的泛素化
        3.3.3 PPARα 蛋白结构中包含RING结构域
        3.3.4 LC/MS/MS分析PPARα 诱导K48-连接的多聚泛素形成
        3.3.5 PPARα 体外泛素化Bcl2
        3.3.6 PPARα/C102A突变体对Bcl2蛋白的半衰期无影响
    3.4 本章小结
第四章 PPARα 和Bcl2相互作用
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验细胞系和实验所需质粒
        4.1.2 实验仪器
        4.1.3 主要实验试剂及其配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 质粒扩增和提取
        4.2.2 细胞培养
        4.2.3 细胞转染
        4.2.4 细胞总蛋白提取
        4.2.5 免疫共沉淀
    4.3 实验结果与分析
        4.3.1 PPARα 与Bcl2生理上相互绑定
        4.3.2 PPARα 与Bcl2的BH3结构域相互绑定
        4.3.3 PPARα/C102是PPARα 与Bcl2相互绑定的关键位点
    4.4 本章小结
第五章 Bcl2的22位赖氨酸残基是泛素化关键位点
    5.1 实验材料
        5.1.1 实验细胞系和质粒
        5.1.2 实验仪器
        5.1.3 主要实验试剂及其配制
    5.2 实验方法
        5.2.1 质粒扩增和提取
        5.2.2 细胞培养
        5.2.3 细胞转染
        5.2.4 细胞处理
        5.2.5 细胞总蛋白提取
        5.2.6 Western blot，免疫沉淀分析
    5.3 实验结果与分析
        5.3.1 PPARα 不能够泛素化降解Bcl2/K22R突变体
        5.3.2 PPARα 对Bcl2/K22R突变体半衰期基本无影响
    5.4 本章小结
第六章 PPARα/Bcl2信号增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性
    6.1 实验材料
        6.1.1 实验细胞系和质粒
        6.1.2 实验仪器
        6.1.3 主要实验试剂及其配制
    6.2 实验方法
        6.2.1 质粒扩增和提取
        6.2.2 细胞培养
        6.2.3 细胞转染
        6.2.4 筛选稳定表达细胞系
        6.2.5 MTT法检测细胞存活率
        6.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡
        6.2.7 细胞总蛋白提取
        6.2.8 Western blot分析
    6.3 实验结果与分析
        6.3.1 在化疗药物刺激下，PPARα 基因沉默增加细胞存活率
        6.3.2 C102位点对PPARα 降低细胞存活率是十分关键的
        6.3.3 在化疗药物刺激下， PPARα 激活下游凋亡信号
        6.3.4 在化疗药物刺激下，PPARα 基因沉默降低细胞凋亡
        6.3.5 C102位点是PPARα 诱导细胞凋亡的关键位点
    6.4 本章小结
第七章 总结
    7.1 PPARΑ 诱导BCL2蛋白水平的降低
    7.2 PPARΑ 作为泛素化连接酶诱导BCL2泛素化降解
    7.3 PPARΑ 和BCL2相互作用
    7.4 BCL2的22位赖氨酸残基是PPARΑ 诱导BCL2泛素化的关键位点
    7.5 PPARΑ/BCL2信号增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性
参考文献
致谢
在学期间的学术成果
参与课题



本文编号：3574591