胃癌来源Exosomes活化的巨噬细胞在胃癌发展中的作用及机制

发布时间：2017-05-13 18:02

  本文关键词：胃癌来源Exosomes活化的巨噬细胞在胃癌发展中的作用及机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探究胃癌来源的外泌体exosomes通过对巨噬细胞的调节促进胃癌发展的作用及机制,为揭示exosomes通过作用巨噬细胞改变胃癌微环境促进胃癌的发展提供理论基础与实验支撑。方法:运用超速离心法从正常胃上皮细胞(GES-1)以及胃癌细胞(MGC-803,SGC-7901)培养上清中提取exosomes,并通过透射电镜、Nanosight技术及Western-blot分析分别对exosomes的形态、数目与表面标记进行鉴定;运用流式细胞成像技术及高内涵荧光显微镜观察exosomes被巨噬细胞内化的现象;通过细胞划痕实验,细胞迁移实验,细胞克隆实验,细胞侵袭实验及细胞凋亡检测探究exosomes作用的巨噬细胞上清对胃癌细胞的影响;Western blot检测exosomes作用后的单核巨噬细胞中NF-κB通路的活化情况;使用小分子抑制剂Bay11-7082阻断巨噬细胞中NF-κB通路的活化;q RT-PCR与ELISA检测exosomes作用后的单核巨噬细胞炎症因子的表达变化。结果:从胃癌上皮细胞株及胃癌细胞株培养上清中成功分离出的exosomes呈现50-100纳米左右的囊泡状,粒子浓度约为1.0×1011/ml到2.5×1011/ml,exosomes表面蛋白标记CD9、CD81为阳性。流式成像检测与高内涵荧光显微镜检查发现,巨噬细胞能够成功地吞噬荧光标记的胃癌细胞来源exosomes。胃癌细胞经MGC-803以及SGC-7901来源的exosomes处理的巨噬细胞上清作用后,其迁移能力与细胞克隆形成能力较对照组明显增强;胃癌细胞来源的exosomes处理巨噬细胞后其上清具有促进MGC-803以及SGC-7901细胞侵袭的功能;而经胃癌细胞来源的exosomes处理的巨噬细胞上清对胃癌细胞的凋亡能力改变无明显作用。胃癌细胞MGC-803以及SGC-7901细胞来源的exosomes作用巨噬细胞后NF-κB通路活化,P-P65表达上调,定量以及ELISA检测IL-6、TNF-α、CCL2基因以及蛋白水平的表达与对照组相比明显上调。使用NF-κB通路抑制剂Bay11-7082预处理THP-1细胞后,胃癌exosomes对单核细胞NF-κB通路活化能力受到抑制,炎症因子IL-6、TNF-α、CCL2的表达亦明显下调,其上清对胃癌的生物学功能无明显改变。应用人外周血巨噬细胞的实验表明,MGC-803来源的exosomes能够活化NF-κB通路,上调炎症因子的表达,促进胃癌细胞的迁移能力,细胞克隆能力与细胞的侵袭能力。结论:胃癌来源的exosomes通过作用肿瘤微环境中的巨噬细胞促进胃癌的进程。本研究揭示了exosomes在胃癌微环境中的新作用,为全面认识exosomes在胃癌进程中的作用提供了新的证据,同时也为胃癌的临床治疗提供了新的治疗思路。
【关键词】：Exosomes 巨噬细胞 微环境 NF-κB 胃癌
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-15
• 第一章 绪论15-21
• 1.1 人胃癌细胞分泌的Exosomes15-16
• 1.1.1 Exosomes的生物学特性15-16
• 1.1.2 Exosomes的分离与纯化16
• 1.2 胃癌Exosomes与肿瘤微环境16-19
• 1.2.1 肿瘤微环境的构成17
• 1.2.2 Exosomes对肿瘤的作用17-18
• 1.2.3 胃癌与NF-κB信号通路18-19
• 1.3 巨噬细胞在胃癌发展中的作用19-21
• 1.3.1 巨噬细胞的特性19
• 1.3.2 巨噬细胞与肿瘤的关系19-21
• 第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义21-24
• 2.1 研究目的21
• 2.2 研究方法21-22
• 2.3 实验设计方案22-23
• 2.4 研究意义23-24
• 第三章 Exosomes的分离与鉴定24-30
• 3.1 材料与仪器24-25
• 3.1.1 主要材料24-25
• 3.1.2 主要仪器25
• 3.1.3 细胞株25
• 3.2 方法25-26
• 3.2.1 细胞的培养及条件培养上清的制备25
• 3.2.2 Exosomes的分离与纯化25-26
• 3.2.3 透射电镜观察Exosomes的形态26
• 3.2.4 纳米示踪分析仪（NTA）检测Exosomes粒子直径及分布26
• 3.2.5 Western blot检测Exosomes表面标记蛋白26
• 3.3 结果26-28
• 3.3.1 Exosomes的形态特征26-27
• 3.3.2 Exosomes数目与粒径分布27-28
• 3.3.3 Exosomes表面蛋白标记的检测28
• 3.4 讨论28-30
• 第四章 巨噬细胞对Exosomes的内化作用30-33
• 4.1 材料与仪器30
• 4.1.1 主要材料30
• 4.1.2 主要仪器30
• 4.1.3 细胞株30
• 4.2 方法30-31
• 4.2.1 高内涵细胞成像分析30-31
• 4.2.2 流式细胞成像分析31
• 4.3 结果31-32
• 4.3.1 巨噬细胞经PMA诱导后形态特征31
• 4.3.2 Exosomes被单核巨噬细胞吞噬31-32
• 4.4 讨论32-33
• 第五章 Exosomes活化的巨噬细胞对胃癌细胞生物学功能的影响33-40
• 5.1 材料与仪器33-34
• 5.1.1 主要材料33
• 5.1.2 主要仪器33-34
• 5.1.3 细胞株34
• 5.2 方法34-36
• 5.2.1 细胞培养及上清的收集34
• 5.2.2 细胞划痕试验34
• 5.2.3 Transwell细胞迁移试验34-35
• 5.2.4 细胞克隆形成实验35
• 5.2.5 细胞侵袭实验35
• 5.2.6 细胞凋亡流式检测35
• 5.2.7 细胞的处理与统计35-36
• 5.3 结果36-38
• 5.3.1 Exosomes活化的巨噬细胞促进胃癌细胞的迁移能力36-37
• 5.3.2 Exosomes活化的巨噬细胞增强胃癌细胞的克隆形成能力37
• 5.3.3 Exosomes活化的巨噬细胞促进胃癌细胞的侵袭能力37-38
• 5.3.4 Exosomes活化的巨噬细胞对胃癌细胞凋亡能力的影响38
• 5.4 讨论38-40
• 第六章 胃癌细胞来源Exosomes活化巨噬细胞机制的研究40-54
• 6.1 材料与仪器40-41
• 6.1.1 主要材料40-41
• 6.1.2 主要仪器41
• 6.1.3 细胞株41
• 6.2 方法41-44
• 6.2.1 细胞的培养与上清的收集41-42
• 6.2.2 细胞蛋白的提取42
• 6.2.3 Western blot42
• 6.2.4 总RNA的提取与逆转录42-43
• 6.2.5 荧光实时定量PCR43
• 6.2.6 ELISA实验43
• 6.2.7 人外周血单核细胞的提取与培养43-44
• 6.2.8 细胞划痕实验44
• 6.2.9 细胞迁移与侵袭实验44
• 6.2.10 细胞克隆实验44
• 6.2.11 数据分析44
• 6.3 结果44-52
• 6.3.1 胃癌来源Exosomes促使巨噬细胞的NF-κB磷酸化激活44-45
• 6.3.2 Bay11-7082抑制胃癌Exosomes对巨噬细胞的活化45-46
• 6.3.3 NF-κB抑制剂处理后的巨噬细胞促迁移能力减弱46-48
• 6.3.4 NF-κB抑制剂处理后的巨噬细胞促增殖与促侵袭能力减弱48-49
• 6.3.5 胃癌来源Exosomes活化外周血巨噬细胞的NF-κB通路49-50
• 6.3.6 Exosomes活化外周血巨噬细胞的NF-κB通路促进胃癌的迁移50-51
• 6.3.7 Exosomes活化外周血巨噬细胞的NF-κB通路促进胃癌的增殖与侵袭51-52
• 6.4 讨论52-54
• 第七章 结论与展望54-55
• 7.1 结论54
• 7.2 展望54-55
• 参考文献55-62
• 致谢62-63
• 攻读硕士学位期间发表的论文及参加会议63

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