微流控数字等温扩增技术研究及其在肝癌miRNA检测的应用

发布时间：2023-01-08 14:49

　　肝癌被誉为“癌中之王”,是最常见的恶性肿瘤之一。中国每年新发肝癌患者约占全球一半以上,死亡率在所有恶性肿瘤中位列第二位,严重威胁人民的生命和健康。肝癌起病非常隐匿,早期无明显症状。约80%的肝癌患者首诊就已进入中晚期,5年生存率几乎为零,而早期肝癌患者经过治疗,5年生存率可达60%以上。因此,早诊早治是对抗肝癌的重要手段。甲胎蛋白（Alpha fetoprotein,AFP）作为一种血清标志物,是诊断肝癌的常用指标。然而,AFP检测的灵敏度较低,仅有60%～70%的早期肝癌患者AFP值呈阳性。同时,常规的影像学检查,如B超和CT难以发现肿瘤直径小于2 cm或密度近似肝实质的早期肝癌。因此,早期肝癌诊断仍面临较高的假阴性率及漏诊率。随着科学的发展和进步,以液体活检（Liquid biopsy）这种侵入式小、灵敏度高的肿瘤诊断技术应运而生。其中,循环miRNA分子标志物检测已被写入2019版《原发性肝癌诊疗规范》,并被纳入肝癌早期检测和诊断临床应用。然而,miRNA是一类长度较短的RNA单链分子,且学术界尚未确定一种合适的miRNA内源性参照基因,极大地影响了其定量结果的准确性,也是一直限... 

【文章页数】：125 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 绪论
    1.1 研究背景
        1.1.1 肝癌早期诊断现状
        1.1.2 肝癌miRNA分子标志物检测及应用
        1.1.3 MiRNA检测技术进展
        1.1.4 数字核酸扩增检测技术发展和应用
        1.1.5 微流控数字等温扩增技术
    1.2 研究意义
    1.3 研究内容
    1.4 技术路线
    1.5 拟解决的关键问题
    1.6 可行性分析
    1.7 本章小结
第2章 用于miRNA快速检测的链置换等温扩增技术研究
    2.1 引言
    2.2 实验部分
        2.2.1 主要试剂和材料
        2.2.2 实验方法
            2.2.2.1 无背景荧光探针链置换扩增(BF-ESDA)系统的构建
            2.2.2.2 BF-ESDA实时荧光定量分析
            2.2.2.3 真实样本试验
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 检测原理
        2.3.2 新型无背景荧光探针设计
        2.3.3 BF-ESDA方法的验证
        2.3.4 BF-ESDA最适反应体系的优化和建立
            2.3.4.1 探针最适浓度优化
            2.3.4.2 Vent (exo-) DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻内切酶最适浓度优化
            2.3.4.3 最适反应温度优化
        2.3.5 BF-ESDA在单样本多靶标检测性能的分析
        2.3.6 BF-ESDA检测灵敏度分析
        2.3.7 BF-ESDA检测特异性分析
        2.3.8 真实样本试验
    2.4 本章小结
第3章 miRNA绝对定量的微流控数字链置换等温扩增检测系统研究
    3.1 引言
    3.2 实验部分
        3.2.1 主要试剂和配置方案
        3.2.2 仪器与设备
        3.2.3 实验方法
            3.2.3.1 自吸分液式高通量芯片制备
            3.2.3.2 数字等温扩增反应体系的配置
            3.2.3.3 芯片注样与油封
            3.2.3.4 数字等温扩增检测和分析
            3.2.3.5 数据分析
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 自吸分液式高通量微流控芯片设计与制备
        3.3.2 芯片进样与油封试验
        3.3.3 芯片防蒸发密封试验
        3.3.4 芯片分液均一性试验
        3.3.5 油液热稳定性试验
        3.3.6 生物兼容性试验
        3.3.7 微反应单元阴阳性结果的界定
        3.3.8 定量准确性和检测灵敏度试验
    3.4 本章小结
第4章 肝癌相关miRNA分子标志物筛选和鉴定
    4.1 引言
    4.2 实验部分
        4.2.1 主要试剂和仪器
        4.2.2 研究对象
        4.2.3 实验方法
            4.2.3.1 miRNA目标分子筛选与鉴定方案
            4.2.3.2 临床样本收集和处理
            4.2.3.3 总RNA提取、反转录及定量分析
            4.2.3.4 数据分析
            4.2.3.5 基因稳定性分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 肝癌miRNA相关分子的筛选
        4.3.2 候选miRNA目标分子的定量分析
        4.3.3 潜在miRNA分子标志物和内参基因的验证
        4.3.4 肝癌miRNA分子标志物的诊断效能评价
        4.3.5 hsa-miR-4644稳定性分析
            4.3.5.1 RT-qPCR定量分析
            4.3.5.2 软件分析和评价
        4.3.6 单内参基因与双内参基因组合的性能对比
        4.3.7 单内参基因与双内参基因组合的稳定性验证
    4.4 本章小结
第5章 肝癌早期诊断模型的建立及应用评价
    5.1 引言
    5.2 实验部分
        5.2.1 主要试剂和仪器
        5.2.2 研究对象
        5.2.3 研究方案
        5.2.4 实验方法
            5.2.4.1 临床样本收集和处理
            5.2.4.2 总RNA提取与质量检测
            5.2.4.3 微流控数字等温扩增试验
            5.2.4.4 肝癌miRNA标志物诊断效能评价
            5.2.4.5 数据处理与分析
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 肝癌miRNA分子标志物表达水平分析
        5.3.2 miRNA分子标志物、AFP及其组合诊断效能分析
        5.3.3 肝癌早期诊断模型的建立
        5.3.4 肝癌早期诊断模型的临床验证
    5.4 本章小结
第6章 总结与展望
    6.1 总结
    6.2 展望
第7章 创新点与不足
    7.1 创新点
    7.2 存在的不足
参考文献
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果



本文编号：3728669