K562细胞规模化培养及砸酸多糖诱导其凋亡的研究

发布时间：2017-06-25 17:16

  本文关键词：K562细胞规模化培养及砸酸多糖诱导其凋亡的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本实验以K562人慢性髓源白血病细胞为研究对象,研究了生物反应器规模化培养K562细胞的基本条件,另外通过MTT法、HE染色、流式细胞术、免疫荧光法和RT-PCR等手段从细胞形态学的变化、细胞周期、线粒体膜电位的变化、相关周期蛋白、相关凋亡蛋白及其基因的表达等方面探讨了硒酸软骨多糖对K562细胞的诱导凋亡作用及其作用机理。首先,对生物反应器规模化培养K562细胞的基本条件,即初始密度、培养基pH值和搅拌速度进行了研究,结果表明,K562细胞规模化培养的最佳条件为：细胞初始密度2.5×105个/mL,培养基pH值7.4,搅拌速度70r/min,该条件下细胞达到的最大生长密度为1.57×106个/mL。其次,研究了硒酸软骨多糖对K562细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用。通过MTT法检测发现硒酸软骨多糖能显著抑制K562细胞的增殖,100μg/mL的软骨多糖作用K562细胞48h后,抑制率可达到80%,且这种抑制作用呈现出明显的浓度依赖性和时间依赖性。通过细胞形态显微镜观察、HE染色和Hoechst33342/PI双染发现硒酸软骨多糖能够使K562细胞出现体积缩小、染色质固缩等典型的凋亡特征。通过流式细胞术发现：(a)硒酸软骨多糖能够将k562细胞阻滞在S期,多糖处理48h后S期细胞数由40.75%增至62.93%；(b)罗丹明-123染色显示强荧光部分的细胞数量降低了18%,细胞线粒体膜电位显著下降。通过免疫荧光和ELISA法检测发现,硒酸软骨多糖处理后,细胞周期相关的Cyclin A、CDK2蛋白和Bcl-2蛋白表达减少,p21蛋白和caspase-9蛋白表达增多；通过实时定量荧光PCR技术对上述蛋白的mRNA表达进行了检测,实验结果与蛋白表达一致。以上结果说明硒酸软骨多糖能够显著抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡。本实验为利用细胞规模化培养生产疫苗、抗体等生物制品奠定了基础。
【关键词】：K562细胞 规模化培养 硒酸软骨多糖 细胞凋亡
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.7
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-23
• 1.1 人慢性髓源白血病(CML)概述8-9
• 1.1.1 CML简介8
• 1.1.2 CML治疗现状8-9
• 1.2 多糖的研究现状9-12
• 1.2.1 多糖概述9
• 1.2.2 多糖的种类9-10
• 1.2.3 多糖的生物活性10-11
• 1.2.4 多糖在抗肿瘤方面的研究11-12
• 1.3 硒多糖12-14
• 1.3.1 硒12
• 1.3.2 硒多糖的来源12-13
• 1.3.3 硒多糖的作用13-14
• 1.4 细胞规模化培养的发展14-16
• 1.4.1 细胞规模化培养技术及应用15
• 1.4.2 细胞规模化培养的影响因素15-16
• 1.4.3 细胞规模化培养的发展16
• 1.5 细胞凋亡16-21
• 1.5.1 细胞凋亡的途径16-19
• 1.5.2 细胞凋亡相关蛋白19-21
• 1.6 本课题研究的目的和意义21-23
• 2 材料与方法23-36
• 2.1 实验材料23-25
• 2.1.1 实验试剂及药品23-24
• 2.1.2 实验仪器及设备24-25
• 2.1.3 实验细胞25
• 2.2 K562细胞规模化培养条件的确定25-26
• 2.2.1 初始密度对细胞生长的影响25
• 2.2.2 培养基最佳pH的确定25-26
• 2.2.3 反应器最佳转速的确定26
• 2.3 硒酸软骨多糖对K562细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用26-36
• 2.3.1 MTT法检测硒酸软骨多糖对K562细胞的增殖抑制作用26-27
• 2.3.2 HE染色检测硒酸软骨多糖对K562细胞的影响27-28
• 2.3.3 Hoechst33342/PI双染法检测硒酸软骨多糖对K562细胞的作用28-29
• 2.3.4 流式细胞仪检测硒酸软骨多糖对K562细胞周期的影响29-30
• 2.3.5 罗丹明-123检测K562细胞线粒体膜电位30
• 2.3.6 免疫荧光30-31
• 2.3.7 ELISA法检测细胞内CDK2和Bcl-2的表达31-32
• 2.3.8 RT-PCR检测细胞内表达水平32-36
• 3 结果与讨论36-51
• 3.1 K562细胞规模化培养条件的确定36-38
• 3.1.1 最佳初始密度的确定36
• 3.1.2 培养基最佳pH的确定36-37
• 3.1.3 反应器最佳转速的确定37-38
• 3.2 硒酸软骨多糖对K562细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用38-51
• 3.2.1 MTT法检测硒酸软骨多糖对K562细胞的增殖抑制作用38-39
• 3.2.2 硒酸软骨多糖作用不同时间K562的形态观察39
• 3.2.3 HE染色检测硒酸软骨多糖对K562细胞的影响39-40
• 3.2.4 Hoechst 33342/PI双染法检测硒酸软骨多糖对K562细胞的作用40-42
• 3.2.5 流式细胞仪检测硒酸软骨多糖对K562细胞周期的影响42-43
• 3.2.6 罗丹明-123检测K562细胞线粒体膜电位43-44
• 3.2.7 免疫荧光44-46
• 3.2.8 ELISA法检测细胞内CDK2和Bcl-2的表达46-47
• 3.2.9 实时定量荧光PCR(RT-PCR)检测相关蛋白mRNA的表达47-51
• 4 结论51-53
• 5 展望53-54
• 6 参考文献54-63
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况63-64
• 8 致谢64

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 丁志山，沃兴德;细胞调亡与动脉粥样硬化[J];中国动脉硬化杂志;1998年01期

2 李妍;纪朋艳;张巍;彭顺利;吕士杰;;柴胡皂苷d对SH-SY5Y细胞ERK蛋白表达及凋亡的影响[J];中国医科大学学报;2013年12期

3 严银芳,陈晓,杨小清,闫远芳;流行性腮腺炎病毒减毒株S_(79)在几株肿瘤细胞和正常细胞中增殖的比较研究[J];肿瘤;2003年06期

4 刘功让;管培中;宋淑亮;逯素梅;冯玉新;辛华;;绞股蓝多糖对四氯化碳损伤HepG2细胞的保护作用[J];山东医药;2007年31期

5 肖东杰,汪运山;B细胞被动凋亡的研究进展[J];国外医学(临床生物化学与检验学分册);1998年05期

6 张运涛,刘凡,姜茹,谷仲平,汪涌,张顺,刘荣福,李玉梅;外源性p27与GRC-1细胞端粒酶活性及细胞凋亡关系的实验研究[J];中国现代医学杂志;2002年09期

7 石和元;王平;胡永年;邱幸凡;田代志;;温胆汤改良方对Aβ_(25-35)诱导AD细胞模型bcl-2、bax蛋白表达的影响[J];世界科学技术;2005年06期

8 孟威宏;王强;王虹蛟;颜炜群;;牛胰蛋白酶抑制剂研究进展[J];国外医学(老年医学分册);2008年04期

9 钟民涛;王晓丽;李星云;刘磊;刘颖丽;张伟;黄敏;;香菇C91-3菌丝发酵蛋白对H22肿瘤细胞体内外抗肿瘤机制的初探[J];中国微生态学杂志;2011年09期

10 张晨,黄世林,马东初,孙英慧,马小锋;硫化砷诱导NB_4细胞调亡[J];白血病;2000年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 邹萍;;血液系统恶性肿瘤细胞来源膜微粒的特征及生物学作用研究[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年

2 蒋争凡;卞婕;翟中和;;非细胞体系诱导小鼠肝细胞核凋亡的超微观察[A];第十次全国电子显微学会议论文集（Ⅰ）[C];1998年

3 陈卫银;祝彼得;刘福友;冯雪梅;;参芎滴丸对急性脑梗死模型大鼠神经细胞调亡的影响[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年

4 谢晶日;李威;梁国英;杨丰源;;胃灵颗粒对胃癌前病变细胞调亡基因影响的实验研究[A];中华中医药学会脾胃病分会第十八次学术交流会论文汇编[C];2006年

5 綦淑芬;万瑞香;姚如勇;;扇贝多肽对Hela细胞在紫外线损伤下的保护作用[A];第五届全国自由基生物学与自由基医学学术讨论会论文摘要汇编[C];2000年

6 吴李君;裴蓓;王顺昌;王军;汤明礼;;砷和镉暴露诱导秀丽小杆线虫生殖腺细胞调亡及其信号通路研究[A];中国毒理学会第二届全国中青年学者科技论坛会议论文集[C];2007年

7 余珂;王敬贤;周炳升;;多溴联苯醚诱导人神经SK-N-SH细胞调亡的机理[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第八届第十七次学术年会论文汇编[C];2007年

8 冉新泽;郑怀恩;王艾平;王锋超;韩京;;他汀对内皮细胞辐射损伤组织因子与细胞调亡的影响[A];中国毒理学会放射毒理专业委员会第七次、中国毒理学会免疫毒理专业委员会第五次、中国环境诱变剂学会致突专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致畸专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致癌专业委员会第二次全国学术会议论文汇编[C];2008年

9 崔承彬;闫少羽;蔡兵;赵庆春;姚新生;曲戈霞;;黑果黄皮Clausena dunniana Levl中咔唑生物碱类新细胞周期抑制剂及细胞调亡诱导剂的核磁共振研究[A];第十一届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];2000年

10 吴耀辉;邹萍;;Sunrivin基因沉默对K562细胞调亡影响的研究[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 张田勘;细胞调亡的意义[N];中国人口报;2002年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 罗晓明;载药聚合物超细纤维作为肿瘤局部制剂的研究[D];西南交通大学;2014年

2 王石;黄芪甲苷促进血管新生的分子机制研究[D];南京中医药大学;2013年

3 宋杨;抗CD25单抗对肾移植患者调节性T细胞生存和功能改变影响的研究[D];复旦大学;2014年

4 罗忠光;CRL E3泛素连接酶靶向新药MLN4924在体内外杀伤肝癌细胞的作用及机制研究[D];复旦大学;2014年

5 肖林林;巨噬细胞对血管细胞的辐射旁效应及其分子机制研究[D];复旦大学;2014年

6 张峰;戊型肝炎病毒基因4型在PLC/PRF/5细胞中的培养及其特征研究[D];北京协和医学院;2014年

7 陈凤华;Tat-SmacN7融合肽对肿瘤细胞辐射增敏作用的研究[D];北京协和医学院;2013年

8 虞志新;Th17/Treg失衡及其与中性粒细胞相互影响在ARDS发病中的作用和机制研究[D];江苏大学;2015年

9 黄凌燕;STK33基因在下咽鳞状细胞癌发生发展中的作用机制研究[D];山东大学;2015年

10 袁媛;let-7c介导c-Myc基因调控逆转肝癌细胞多药耐药的机制研究[D];兰州大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 张晓娇;天然抗氧化剂对乳腺癌MCF-7/ADM细胞的耐药逆转作用及机制研究[D];河北联合大学;2014年

2 吕超绍;重组人干扰素γ(rhIFN-γ)对白血病K562细胞免疫逃逸的影响[D];昆明理工大学;2015年

3 汪建阳;Ang-(1-7)通过G蛋白偶联受体Mas对人肝癌HepG2细胞的影响研究[D];广西医科大学;2015年

4 任志涛;小檗碱对TGF-β1诱导A549细胞上皮间质转化和MRC-5细胞转分化及细胞信号通路相关蛋白的影响[D];北京协和医学院;2015年

5 杨晓姗;重组人p66Shc腺病毒和赖氨藤黄酸盐对肿瘤细胞的抑制作用及机制[D];北京协和医学院;2015年

6 万爱英;大分割照射生物效应实测数据与LQ公式计算数据的比较研究[D];北京协和医学院;2015年

7 邢晓萌;白藜芦醇对肺癌A549细胞的放射增敏作用及其机制研究[D];北京协和医学院;2015年

8 曹曰针;胞外泛素对Treg细胞免疫抑制活性的影响[D];复旦大学;2014年

9 张晓威;OSW-1与线粒体DNA缺失对肝癌细胞PI3K信号通路的影响[D];延边大学;2015年

10 余长松;胰高血糖素样肽-2对IPEG-J2细胞紧密连接表达与屏障功能的影响及其分子机制研究[D];四川农业大学;2014年

  本文关键词：K562细胞规模化培养及砸酸多糖诱导其凋亡的研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：482946