EZH2在神经母细胞瘤中的表达及其相关研究

发布时间：2017-06-26 19:11

  本文关键词：EZH2在神经母细胞瘤中的表达及其相关研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的:神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见的颅外实体瘤,目前国内对早期、低危NB已取得较好的治疗效果,但晚期NB,虽然结合运用了手术、大剂量化疗、放疗及自体干细胞移植等手段,患儿五年生存率仍维持在50%左右,单纯地加大手术、放化疗强度已经很难有效提高患儿的治疗效果,未来的治疗方向应该是更加特异性、敏感性的治疗手段—分子靶向治疗。因此,寻求新而有效的潜在NB分子靶点具有重要意义。EZH2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)蛋白是多梳抑制复合物2(polycomb repressor complex 2,PRC2)的核心催化元件,通过促使组蛋白H3甲基化对靶基因的转录起调控作用。研究显示,EZH2高表达是多种癌病预后不良的因素,在NB中,同样发现EZH2在表观遗传上沉默NB抑癌基因CASZ1、CLU、RUNX3和NGFR,提示EZH2可做为NB分子靶向的潜位点。本课题的研究目的在于检测EZH2蛋白在NB组织水平中的表达情况,并结合临床资料分析其表达水平与NB患儿临床病理因素和生存预后的关系,然后在NB细胞系中稳定过表达和降表达EZH2,进一步研究EZH2对NB发生发展的作用机制。研究方法和主要结果:1.EZH2在神经母细胞瘤组织中的蛋白表达情况方法:利用免疫组化的方法检测74例NB组织中EZH2的表达情况。结果:74例患儿中阴性表达EZH2 2例,弱阳性表达EZH2 21例,阳性表达EZH231例,强阳性表达EZH2 20例,即EZH2弱表达23例,强表达51例。2.EZH2表达与NB患儿临床病理特点及生存预后分析方法:利用SPSS19.0统计学软件分析EZH2表达情况与NB患儿临床病理因素之间和患儿生存预后的相关性。结果:经统计学分析,EZH2强表达与患儿肿瘤高分期(X2=6.931,P=0.008)、肿瘤伴有远处转移(X2=5.722,P=0.017)及Ki67强表达(X2=29.827,P=0.000)正相关,与短期治疗效果达VGPR以上呈一定的负相关,P值接近0.05(X2=4.045,P=0.052)。分析EZH2表达与患儿治疗后复发情况提示,EZH2强表达与患儿复发存在一定的相关性,但P值大于0.05(X2=2.699,P=0.100)。而EZH2表达情况与患儿年龄、性别、原发部位及病理类型未见明显相关性(P0.05)。3.构建稳定过表达和降表达EZH2的NB细胞系,并分析其对NB细胞生物学行为的影响方法:通过构建过表达EZH2和小RNA干扰下调EZH2的慢病毒表达质粒的方法,建立稳定过表达和降表达EZH2的NB细胞系,并利用MTT、Edu增殖实验和Transwell等方法研究EZH2对NB细胞的生长增殖和迁移的影响。结果:(1)成功建立稳定过表达EZH2的NB细胞系SK-N-BE(2)-EZH2-COPGFP和降表达EZH2的NB细胞系SK-N-BE(2)-sh EZH2-74、SK-N-BE(2)-sh EZH2-77,并Western Blotting验证;(2)在SK-N-BE(2)细胞中稳定过表达EZH2后,细胞增殖能力和迁移能力均较对照和空白组增强;(3)在SK-N-BE(2)细胞中利用小RNA干扰下调EZH2表达后,细胞增殖能力和迁移能力均较对照和空白组明显减弱。4.EZH2在NB诱导分化中的作用影响方法:利用反式维甲酸(Retinoic Acid,RA)和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromodeoxyuridine,Brdu)诱导NB细胞系分化后,研究EZH2对NB诱导分化的作用影响。结果:(1)经RA诱导刺激后,SK-N-BE(2)细胞出现明显的神经分化,神经轴突丝明显,相互交错,胞体变小,细胞胞体之间聚集,囊泡分泌增多,呈神经节样生长,细胞生长速度明显变慢;(2)经Brdu诱导刺激后,SK-N-BE(2)细胞形态学未发生明显变化,但扁平宽大细胞(类似基质细胞)成份略增多,细胞生长速度未见明显差异;(3)经RA刺激后,EZH2、CD133和Vimentin蛋白均明显减少,而Brdu诱导后EZH2和Vimentin蛋白表达增多,而CD133蛋白变化不明显。结论:1.EZH2在高分期、伴有远处转移的NB患儿组织中高表达,与Ki-67表达成显著正相关性,并与患儿预后负相关,提示EZH2是NB的一个促癌因素;2.细胞功能实验显示,EZH2促进SK-N-BE(2)细胞的生长增殖和迁移;3.RA和Brdu诱导刺激SK-N-BE(2)后,EZH2蛋白表达发生明显变化,提示其可能参与NB的肿瘤干细胞维持和诱导分化。
【关键词】：EZH2 神经母细胞瘤 靶向治疗 分化 预后
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.4
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 对象和方法15-32
• 1.1 实验材料15-21
• 1.1.1 细胞系15
• 1.1.2 病理切片标本及临床资料收集15
• 1.1.3 质粒15
• 1.1.4 常规试剂和耗材15-16
• 1.1.5 各实验所需主要抗体16
• 1.1.6 各实验所需主要试剂配制16-21
• 1.2 主要实验仪器21
• 1.3 主要实验方法21-31
• 1.3.1 免疫组化和表达情况评分21-22
• 1.3.2 免疫组织化学染色评价方法22
• 1.3.3 质粒构建、提取及鉴定方法22-24
• 1.3.4 细胞培养及传代24-25
• 1.3.5 细胞冻存25
• 1.3.6 细胞复苏25-26
• 1.3.7 钙法转染制备慢病毒26
• 1.3.8 慢病毒感染细胞26-27
• 1.3.9 提取细胞全蛋白27
• 1.3.10 Western Blotting27-28
• 1.3.11 Transwell体外迁移实验（Transwell assay）28-29
• 1.3.12 Edu细胞增殖实验29-30
• 1.3.13 细胞生长曲线（MTT）实验30
• 1.3.14 RA和Brdu诱导刺激30-31
• 1.4.病例随访及统计学方法31-32
• 1.4.1 病例随访31
• 1.4.2 统计学方法31-32
• 结果32-44
• 2.1 EZH2蛋白表达情况与NB临床病理指标之间的关系32-35
• 2.2 EZH2蛋白表达情况与NB临床预后之间的关系35-37
• 2.3 EZH2过表达及shEZH2慢病毒质粒的成功构建37-38
• 2.4 稳定过表达和降表达EZH2的NB细胞系(SK-N-BE(2)-EZH2-COPGFP、SK-N-BE(2)-shEZH2-74和SK-N-BE(2)-shEZH2-77)的成功建立38-39
• 2.5 稳定过表达和降表达EZH2后对NB细胞生长增殖和迁移能力的影响39-41
• 2.6 反式维甲酸和Brdu诱导NB细胞分化后，，EZH2蛋白表达水平发生变化41-44
• 讨论44-47
• 3.1 EZH2强表达是NB的促癌因素，有望成为未来NB的靶向位点44-45
• 3.2 EZH2可能参与NB的诱导分化调控45
• 3.3 EZH2可能参与NB肿瘤干细胞的干性维持45-47
• 结论47-48
• 参考文献48-51
• 发表论文和参加科研情况说明51-52
• 综述 外周神经母细胞性肿瘤分化及去分化的相关研究进展52-65
• 综述参考文献59-65
• 致谢65-67
• 个人简历67

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本文编号：487279