盐酸千金藤碱逆转食管鳞状细胞癌顺铂耐药的作用机制研究

发布时间：2017-06-30 03:45

  本文关键词：盐酸千金藤碱逆转食管鳞状细胞癌顺铂耐药的作用机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:食管癌是一种常见的极具危害性的食管粘膜上皮恶性肿瘤。目前,临床治疗恶性肿瘤的方法是以手术辅以放化疗为主。但恶性肿瘤患者对化疗产生耐药造成多药耐药性(multidrug resistance,MDR)引起死亡是临床上化疗治疗肿瘤亟待解决难题之一。因此,探讨与研发恶性肿瘤MDR的有效逆转剂,提高恶性肿瘤对临床一线化疗药物的敏感性,具有极其重要的意义。迄今,已经发现的部分有MDR逆转作用的化合物大多数由于毒副作用较大,限制了其临床应用。盐酸千金藤碱(cepharanthine hydrochloride,CEH)是千金藤素(cepharanthine,CEP)经半合成成盐所得到的化合物,CEH具有多种生物活性作用。CEH能否逆转食管癌鳞状细胞癌细胞的耐药性且作用机制如何,目前尚未见报道。本实验拟通过建立内外模型考察CEH对肿瘤细胞耐药性的逆转作用,并采用细胞和分子生物学的方法对其逆转肿瘤细胞耐药性的分子机制进行深入探讨。方法:实验选择人食管癌鳞状细胞癌细胞株Eca109及耐顺铂细胞株Eca109-CDDP,懫用MTT分析法,测定CEH单用及与CDDP合用对Eca109、Eca109-CDDP细胞的直接细胞毒作用,并绘制两药联用抑制率-联合指数图;Annexin V/PI双染色法和Western blot检测细胞凋亡及与凋亡相关的蛋白表达与活化;懫用Western blot和RT-PCR法分别检测CEH单用及与CDDP合用后,Eca109-CDDP细胞中P-gp及MDR1 mRNA表达的变化,考察CEH对顺铂耐药的逆转作用;采用Western blot法检测CEH对转录因子c-Jun蛋白的表达和活化的影响。将Eca109-CDDP细胞通过裸鼠腋下接种建立耐药荷瘤动物模型,观察CEH在荷瘤小鼠体内对肿瘤生长的抑制作用。采用免疫组化法检测CEH在体内干预后实体瘤中c-Jun和磷酸化c-Jun蛋白表达水平的变化,采用免疫荧光方法在该模型中研究CEH在体内干预后实体瘤中P-gp蛋白表达水平的变化。结果:1.在1-20.0μM浓度范围内,CEH能够增强CDDP诱导食管癌鳞状细胞癌细胞发生凋亡,下调Bcl-2/Bax的比例,增强CDDP诱导的PARP剪切。2.在上述浓度范围内,CEH对P-gp及MDR1 mRNA的表达的抑制作用逐渐增强。即CEH下调MDR1 mRNA的表达和P-gp蛋白的表达呈浓度依赖性;Bcl-2的表达量逐渐降低而c-Jun、p-c-Jun及JNK的表达量逐渐增加。3.在2.5-10.0mg/kg浓度范围内的CEH联合CDDP的化疗方案对食管癌鳞状细胞癌荷瘤小鼠的肿瘤生长有不同程度的抑制。与CDDP和CEH单药组相比,CDDP联用CEH组的抑瘤作用增强,且抑瘤作用与CEH呈剂量依赖性,10.0 mg/kg CEH联合CDDP化疗方案对肿瘤的抑制作用最强。4.CEH在荷瘤小鼠体内同样可以浓度依赖性的下调P-gp蛋白的表达,增加c-Jun、p-c-Jun及JNK的表达。结论:1.CEH在体内外都能够促进CDDP对食管癌的增殖的抑制作用,并且能够促进CDDP诱导的食管癌鳞状细胞癌细胞发生凋亡。2.CEH逆转Eca109-CDDP细胞的耐药性作用与降低Bcl-2的表达、增强c-Jun的表达和磷酸化有关。CEH可能是通过活化c-Jun/JNK信号转导通路进而调节MDR1mRNA和P-gp的表达,发挥其逆转食管癌鳞状细胞癌顺铂耐药的作用。3.CEH可能是通过抑制P-gp的表达而发挥在耐药性实体型动物肿瘤模型体内逆转肿瘤顺铂耐药的作用。意义:本实验首次阐明CEH可有效逆转Eca109-CDDP细胞的耐药性及其分子机制,为其研究开发并作为肿瘤化疗的耐药逆转剂提供了实验依据。
【关键词】：盐酸千金藤碱 多药耐药 MDR1 P-gp Bcl-2 c-Jun/JNK 食管癌
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 缩写词及中英文对照8-14
• 前言14-20
• 1. 食管癌鳞状细胞癌的研究现状14-15
• 2. ESCC临床治疗策略15-16
• 3. 小分子化合物与肿瘤耐药16-18
• 4. 千金藤碱与肿瘤多药耐药18-20
• 第一章 CEH和CDDP联用抑制食管癌鳞状细胞癌细胞生长20-32
• 1. 仪器与材料20-22
• 1.1 仪器与耗材20-21
• 1.2 主要试剂21-22
• 1.3 细胞株22
• 1.4 试剂配制22
• 2. 实验方法22-24
• 2.1 细胞复苏22-23
• 2.2 细胞培养23
• 2.3 细胞冻存23
• 2.4 MTT法检测CHE和CDDP单用及联用对食管癌鳞状细胞癌细胞增殖抑制23-24
• 2.5 细胞形态学观察和耐药指数( Resistance index, RI )测定24
• 2.6 CEH和CDDP联合指数( Combination index, CI )测定24
• 2.7 统计学分析24
• 3. 实验结果24-30
• 3.1 Eca109及Eca109-CDDP细胞形态学观察及耐药细胞株耐药指数的测定24-26
• 3.2 CEH对正常细胞毒性26-27
• 3.3 CEH和CDDP抑制人食管癌鳞状细胞癌细胞的生长且联用能显著增加人食管癌鳞状细胞癌细胞对CDDP的敏感性27-30
• 4. 讨论30-31
• 5. 本章小结31-32
• 第二章 CEH联用CDDP诱导人食管鳞癌细胞凋亡32-45
• 1. 仪器与材料32-36
• 1.1 仪器与设备32
• 1.2 实验材料32-33
• 1.3 实验所用抗体33
• 1.4 实验主要溶液配制方法33-36
• 1.4.1 WB相关试剂配制33-36
• 1.4.2 其他试剂配制36
• 2. 实验方法36-39
• 2.1 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡36
• 2.2 WB法检测细胞蛋白表达36-39
• 2.2.1 细胞总蛋白的提取36-37
• 2.2.2 测定细胞蛋白浓度37
• 2.2.3 SDS-PAGE电泳37
• 2.2.4 转膜37-38
• 2.2.5 封闭38
• 2.2.6 一抗孵育38
• 2.2.7 二抗孵育38
• 2.2.8 辣根过氧化物酶ECL显影38
• 2.2.9 灰度分析38-39
• 3. 实验结果39-40
• 3.1 CEH与CDDP联合促进细胞凋亡39
• 3.2 CEH与CDDP联合对细胞凋亡蛋白表达的影响39-40
• 4. 讨论40-41
• 5. 本章小结41-45
• 第三章 盐酸千金藤碱逆转肿瘤多药耐药性的信号转导机制45-54
• 1. 仪器与材料45-46
• 1.1 仪器与耗材45-46
• 1.2 实验材料46
• 1.3 主要试剂配制46
• 1.3.1 RNA提取所用溶液配制46
• 2. 实验方法46-48
• 2.1 细胞总RNA的提取46-47
• 2.2 反转录成c DNA47
• 2.3 Real-time PCR47-48
• 3. 实验结果48-53
• 3.1 RT-PCR法检测人食管癌鳞状细胞癌细胞中MDR1 m RNA随CEH浓度变的化情况48-50
• 3.2 WB法检测CEH在人食管癌鳞状细胞癌细胞中对P-gp的调节作用50-51
• 3.3 WB法检测CEH在人食管癌鳞状细胞癌细胞中对Caspase 3 的调节作用51
• 3.4 WB法检测CEH对JNK信号通路的影响51
• 3.5 WB法检测CEH对其他信号通路的影响51-53
• 4. 讨论53
• 5. 本章小结53-54
• 第四章 CEH和CDDP联用体内抗食管癌研究54-70
• 1. 仪器与材料54-55
• 1.1 仪器与耗材54
• 1.2 试剂和药物54-55
• 1.3 药物配制55
• 1.4 实验动物及饲养环境55
• 2. 实验方法55-57
• 2.1 动物实验55-56
• 2.2 H&E染色、免疫组化、免疫荧光56-57
• 3. 实验结果57-60
• 3.1 CEH与CDDP联用对裸鼠移植瘤的生长抑制及毒性作用57-59
• 3.2 CEH与CDDP联用可以促进裸鼠移植瘤内细胞的凋亡59-60
• 3.3 CEH与CDDP联用可以激活荷瘤小鼠体内c-Jun/JNK信号通路，抑制P-gp的表达60
• 4. 讨论60-61
• 5. 本章小结61-70
• 结论70-71
• 主要创新点71-72
• 展望72-73
• 参考文献73-80
• 致谢80

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