肝癌HepG2细胞内质网应激后COX2表达上调机制及其抗凋亡机制的研究

发布时间：2017-07-05 20:06

  本文关键词：肝癌HepG2细胞内质网应激后COX2表达上调机制及其抗凋亡机制的研究

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【摘要】：目的:明确肝癌Hep G2细胞内质网应激后COX2表达上调的机制,并对其抗凋亡的分子机制进行初步探讨。方法:免疫组化法检测COX2、ATF6、IRE1、PERK的表达并分析其相关性;转染si-RNA抑制UPR通路相关蛋白的表达;RT-q-PCR法检测COX2 m RNA的表达;TUNEL法观察细胞凋亡的形态学变化;Annexin V+PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot法检测COX2、CHOP、Bcl2、Bax表达的变化。结果:1.肝癌组织COX2、ATF6、IRE1、PERK的表达情况及COX2与ATF6、IRE1、PERK的相关性分析采用免疫组化法检测COX2、ATF6、IRE1、PERK的表达并分析其相关性,结果显示:164例肝癌患者中,COX2阳性患者109例,阴性患者55例;ATF6阳性患者134例,阴性患者30例;IRE1阳性患者90例,阴性患者74例;PERK阳性患者91例,阴性73例。COX2与ATF6的表达呈正相关(r=0.198,P=0.011)。2.si-ATF6、si-IRE1、si-PERK转染效率的检测使用倒置荧光显微镜观察转染后荧光强度,Western blot检测转染后相关蛋白的表达,最终筛选出si-ATF6-2、si-IRE1-3和si-PERK-3三条同源序列具有较高的转染效率,能分别有效抑制ATF6、IRE1、PERK蛋白的表达。3.抑制UPR通路对ERS后Hep G2细胞COX2表达的影响3.1 RT-q-PCR法检测COX2 m RNA的表达变化使用RT-q PCR法定量检测COX2 m RNA的表达,结果可见:TM组的COX2m RNA表达相比空白组明显增加(P0.01),应用si-RNA抑制UPR通路后,TM+si-ATF6组COX2 m RNA表达较TM组和NC组显著减少(P0.01),而TM+si-IRE1组、TM+si-PERK组的COX2 m RNA的表达未见明显变化。使用Western blot法检测COX2蛋白的表达变化。结果可见:TM组与空白组相比COX2蛋白表达明显增加(P0.01);TM+si-ATF6组COX2蛋白表达相比TM组和NC组显著减少(P0.01)。TM+si-IRE1组、TM+si-PERK组的COX2蛋白的表达未见明显变化。4.抑制ATF6表达对ERS后Hep G2细胞凋亡的影响4.1 TUNEL法观察Hep G2细胞凋亡的形态学改变使用TUNEL法从形态学观察细胞凋亡,结果可见:空白对照组凋亡细胞百分比为:4.10±0.94%,TM组凋亡细胞百分比为:15.85±2.43%,TM+NC组凋亡细胞百分比为:17.42±2.15%;TM+si-ATF6组凋亡细胞百分比为:34.62±3.28%。TM+si-ATF6组的凋亡细胞百分比明显高于TM组(P0.01)和空白对照组(P0.01)。4.2 FCM检测Hep G2细胞凋亡率使用Annexin V-PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,结果可见:空白对照组细胞凋亡率为:4.97±0.34%,TM组凋亡率为:10.87±1.30%,TM+NC组凋亡率为:11.49±2.22%;TM+si-ATF6组凋亡率为:26.95±3.42%。TM+si-ATF6组的细胞凋亡率较空白对照组(P0.01)和TM组(P0.01)显著增加。5.COX2表达上调抑制Hep G2细胞凋亡的机制探讨转染si-ATF6抑制ERS后Hep G2细胞的COX2表达,用Western blot法检测CHOP、Bcl2、Bax蛋白的表达,结果显示:TM+si-ATF6组与空白对照组(P0.01)和TM组(P0.01)相比CHOP表达明显增加,Bcl2/Bax比值显著降低(P0.01)。3.2 Western blot法检测COX2蛋白的表达变化结论:在ERS后的肝癌Hep G2细胞中,ATF6通路的激活是COX2表达上调的重要机制之一。ERs后Hep G2细胞中表达上调的COX2可能通过抑制CHOP的表达,并上调Bcl2/Bax比,从而产生凋亡抵抗。
【关键词】：肝癌 内质网应激 COX2 凋亡 ATF6
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中英文缩略词5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 1. 前言12-14
• 2. 实验材料14-17
• 3. 实验方法17-25
• 4. 结果25-37
• 5. 讨论37-41
• 6. 结论41-42
• 7. 参考文献42-48
• 附录48-49
• 个人简历48
• 攻读硕士期间发表的论文48
• 参与的科研项目48
• 荣誉奖励48-49
• 致谢49-50
• 综述50-61
• 参考文献55-61

【参考文献】

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1 Isabel Fabregat;;Dysregulation of apoptosis in hepatocellular carcinoma cells[J];World Journal of Gastroenterology;2009年05期

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本文编号：523397