非小细胞肺癌中靶向调控MTA1基因microRNA的鉴定及其表达调控机制

发布时间：2017-07-07 09:05

  本文关键词：非小细胞肺癌中靶向调控MTA1基因microRNA的鉴定及其表达调控机制

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【摘要】：研究背景：肺癌是世界上死亡率最高的恶性肿瘤,有将近80-85%的肺癌患者为非小细胞肺癌(NSCLC)。大约有56%的肺癌患者在确诊时为肺癌晚期,而仅有15%的患者在早期被发现,故肺癌的5年总生存率也仅有17.1%。众所周知,肿瘤转移是制约非小细胞肺癌患者治疗效果和总生存率的重要因素。因此,关于肿瘤转移的分子机制方面的研究对于疾病的发生和开发新的靶向药物治疗都是非常有必要的。最初,转移相关基因(MTA1)是在鼠转移性乳腺癌中经cDNA库差异筛选技术发现的,是一种与肿瘤转移相关的基因。它在非小细胞肺癌、结直肠癌、肝细胞癌及乳腺癌等许多肿瘤中都是高表达的。在过去的几十年里,作为核小体重塑和去乙酰化(nucleosome remodeling and deacetylating,NuRD)复合物不可缺的亚基之一,MTAl可以在转录和非转录水平调控DNA损伤应答、上皮间质转化(EMT)及炎症的形成。然而,为了使MTAl的分子靶向治疗成为可能,我们就必须对MTA1的异常表达机制做进一步研究。微小RNA(miRNAs)是一种小的非编码RNA,它是由18-23个核苷酸组成。miRNA可以通过与信使RNA(mRNA)的3’或5’非编码区(UTR)结合,导致mRNA降解、翻译抑制或活化、形成异染色质,从而调控基因的表达。大量研究表明,通过调控不同的基因,miRNA可以在肿瘤中发挥促癌或抑癌的作用。例如,miR-200家族可以抑制肿瘤的EMT通过调节PTEN信号通路,miR-21可以促进非小细胞肺癌细胞的侵袭和迁移能力。目前已有文献报道,MTA1可以与miRNA相互作用,但仅为冰山一角,miRNAs与MTA1之间的调控关系仍需进一步的研究。这里,我们运用生物信息学分析软件分析靶向调控MTAl的miRNAs。我们基于两个常用的生物信息学预测网站(Targetscan和microrna.org),预测出miR-199a/b-5p, miR-125a-3p共3个候选miRNAs可能与MTAl的3’非编码区结合。并且,通过查阅文献,我们发现这3个候选miRNAs都可作为抑癌基因抑制肿瘤迁移和侵袭。在本研究中,我们拟通过生物信息学网站预测并结合文献报道,筛选出与非小细胞肺癌中靶向MTA1 3'UTR的候选miRNA,再用双荧光素酶报告基因系统验证候选miRNA通过直接与MTA1 3'UTR结合在转录后水平调节其表达。并通过一系列体外实验证实MTAl介导了候选miRNA对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭迁移能力的影响。最后,在非小细胞肺癌组织标本中证实候选miRNA与MTAl表达之间的相关性。材料和方法组织标本本研究所用8对肺癌组织手术样本(癌和癌旁)来自8位病人,他们均在南方医院接受手术,而且这8位病人在手术前均未接受过化疗或放疗。这些组织的病理诊断均由南方医院病理科提供,包括3例肺鳞癌(高分化1例、中分化2例),其余5例为肺腺癌(高分化1例,中分化2例、低分化2例)。这些标本收集后立即放入液氮中保存。细胞培养HEK-293T,SPC-A-1和95D细胞系均购自中国科学院上海细胞库,并采用含10%胎牛血清的DMEM (Gibco)培养基培养,并放置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。载体构建候选miRNA的mimics,抑制MTA1的小干扰RNA(si-MTA1)以及它们的阴性对照都是由上海吉玛公司合成,它们的序列分别是：miR-199a-5p mimics: 5'-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3',miR-199b-5p mimics:5'-CCCAGUG UUUAGACUAUCUGUUC-3', miR-125a-3p mimics:5'-ACAGGUGAGGUU CUUGGGAGCC-3'; mimics/NC:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3', si-MTA1:5'-CCAGCAUCAUUGAGUACUATT-3';非特异干扰对照：5'-GCGACGAUCUGCCUAAGAUdTdT-3'瞬时转染接种适量的细胞于六孔板中,18-24h后按照Lipofectamine 3000(Invitrogen)说明书转染miRNA mimics或siRNAs(100μM),转染后培养48h。蛋白质免疫印迹细胞在转染后48小时收获,用收集的细胞提取总蛋白,并用10%的SDS-PAGE胶跑蛋白质电泳,将不同分子量的蛋白质区分开,然后再转到PVDF膜(Millpore)上。所用的一抗抗体均为单克隆抗体：MTAl配比是1：1500(Abcam, Cambridge, USA);β-actin配比是1:5000(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)。RNA提取和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)利用美国英潍捷基公司的Trizol裂解液提取细胞和组织的总RNA。利用TaqMan Reverse Transcription Kit (Takara, Dalian, China)进行mRNA的逆转录、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Takara, Dalian, China)进行miRNA的逆转录。分别使用miRscript SYBR Green PCR kit和SYBR Green PCR Kit (Takara, Dalian, China),并在Roche LightCycler 480 (Roche, Switzerland)仪器上进行miRNA和mRNA的实时荧光定量。我们选用U6作为miRNA的内参,GAPDH作为mRNA的内参。采用公式RQ=2-△△ct计算目的基因相对于内参基因的表达量。双荧光素酶报告基因系统由上海吉玛公司将miR-125a-3p与MTA1 3'UTR结合位点突变序列和未突变序列构建到pmirGLO载体内,再将HEK293T和SPC-A-1细胞接种于24孔板,培养1天后用于共转染实验。将50 ng野生型或突变型的荧光素酶质粒和20 pMmiR-125a-3p mimics或阴性对照共转染细胞。转染48h后,运用Promega公司的双荧光素酶报告基因系统检测试剂盒检测细胞的荧光活性。细胞增殖实验将转染24h后的细胞接种到96孔板中,每孔3×103个细胞,培养1至5天。在接下来的第1、3、5天,分别在每个孔中加入20μl的MTT(5 mg/ml;Sigma, St. Louis, Missouri, USA),放孵箱孵育4h。然后弃上清,加入150μl DMSO溶液,震荡摇匀后用酶标仪(ELx800; BioTek, Winooski, USA)检测490nm波长时每孔的吸光值(OD值)。EDU细胞增殖检测实验使用的是广州瑞博公司的EDU检测试剂盒,具体实验步骤参照说明书。我们将转染后48h的细胞接种到6孔板中,500个/孔,并用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养10-14天,然后再用4%的甲醇固定细胞,并用0.1%的结晶紫染色,显微镜下计数≥50个细胞的克隆团个数。迁移和侵袭实验划痕实验6孔板每孔接种5×105个细胞,培养24h后共转染miRNA mimics或miR-NC和si-MTAl或si-NC,转染后24h用200μl的枪头垂直划向孔底,并将完全培养基换成无血清培基,在0h和48h时拿去显微镜下拍照。Transwell迁移及侵袭实验将共转染miRNA mimics或 miR-NC和si-MTAl或si-NC的细胞培养24h后,用无血清培养基重悬铺到Transwell上室(侵袭实验还需要在接种细胞之前在小室上铺一层基质胶),以每孔5万个细胞量接种于Transwell上室,在下室中加入500gL含10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃,5%C02,培养24h。24h后,用4%多聚甲醛固定transwell、室5 min,用0.1%的结晶紫染色5 min。统计学分析采用SPSS14.0软件进行统计分析,实验数据以均数士标准差表示,两样本均数的比较采用两独立样本的t检验(two-tailed unpaired Student's t-test), miR-125a-3p和MTA1的相关性分析采用Spearman's相关,P值0.05表示有统计学意义。结果1、调控MTA1的上游靶基因的筛选和鉴定在NSCLC中MTA1扮演着促癌基因的角色,并发挥着举足轻重的作用。为了探究aiR-199a-5p, miR-199b-5p和miR-125a-3p3个候选抑癌miRNA中究竟哪个miRNA可以下调MTA1的表达,我们采用qRT-PCR和Western blotting在SPC-A-1和95D细胞中作进一步验证,发现3个候选miRNA并不影响MTA1的mRNA水平,而miR-125a-3p可以下调MTA1的蛋白表达,miR-199a-5p和miR-199b-5p则对M TA1的蛋白水平表达没有明显的影响。证实了miR-125a-3p可以在转录后水平调控MTA1表达,抑制其蛋白翻译。我们运用Targetscan和microrna.org两个常用的生物信息学预测网站来预测miR-125a-3p在MTA1的3'UTR区较为稳定及保守的结合位点。为了进一步证明miR-125a-3p和MTA1的直接靶向调控关系,我们又将含有MTA1 3'UTR野生型及突变型的荧光素酶报告基因质粒分别与niR-125a-3p mimics及阴性对照共转染到HEK293T和SPC-A-1细胞中,并检测荧光素酶的活性。结果显示在HEK293T和SPC-A-1细胞中miR-125a-3p均可抑制MTA1 3'UTR野生型荧光素酶报告基因载体的活性,对突变型无影响,进一步证实了miR-125a-3p可以直接靶向MTA1的3’UTR在转录后水平调控MTA1。2、miR-125a-3p靶向MTAl对NSCLC生物学功能的影响首先,我们检测了共转染miR-125a-3p和si-MTA1的SPC-A-1和95D细胞株中miR-125a-3p的表达以及对MTA1 mRNA和蛋白水平的干扰效率,证明了转染的有效性。也再次证实了miR-125a-3p可以下调MTA1的蛋白水平,并不影响MTA1的mRNA表达。MTT和克隆形成实验发现用siRNA干扰MTA1的表达可以抑制肺癌细胞的增殖活性和克隆形成率,与miR-125a-3p在肺癌细胞中所发挥的抑制细胞增殖的作用相仿,并能进一步增强miR-125a-3p对细胞增殖的抑制功能。在EDU细胞增殖检测中也得到了同样的结果。提示miR-125a-3p靶向MTA1抑制了NSCLC细胞的增殖能力。为了检测miR-125a-3p是否通过靶向MTA1影响NSCLC细胞的侵袭和迁移能力,我们进行了划痕实验和transwell实验(铺胶或不铺胶),发现过表达miR-125a-3p和干扰MTA1均能抑制细胞的侵袭和迁移,而且共转染miR-125a-3pmimics和si-MTA1的SPC-A-1和95D细胞侵袭和迁移的能力与单独转染miR-125a-3p mimics或si-MTA1的细胞相似。MTA1介导了miR-125a-3p对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭迁移能力的影响。3、miR-125a-3p与MTAl在NSCLC组织中的表达相关性在体外实验中,我们已经验证了miR-125a-3p可以直接靶向调控MTA1蛋白表达,于是我们猜想在NSCLC组织中miR-125a-3p和MTA1之间是否存在同样的相关性。我们用了8对NSCLC临床标本检测miR-125a-3p和MTA1蛋白的表达,并用Spearman相关性检验检测miR-125a-3p和MTA1蛋白表达之间的相关性,发现在N SCL C组织中miR-125a-3p和MTA1之间存在负相关(r=-0.762,P=0.028)。结论1、niR-125a-3p直接作用于MTA1的3'UTR在转录后水平下调MTAl的蛋白表达；2、miR-125a-3p通过靶向调控MTA1抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移能力；3、miR-125a-3p与MTA1蛋白表达在NSCLC组织中呈负相关。
【关键词】：MiR-125a-3p MTA1 非小细胞肺癌 增殖 侵袭 迁移
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-24
• 技术路线24-25
• 第一章 调控MTA1的上游靶基因的筛选与鉴定25-45
• 前言25
• 1.1 材料和仪器25-26
• 1.2 方法26-39
• 1.3 结果39-42
• 1.4 讨论42-45
• 第二章 miR-125a-3p靶向MTA1对NSCLC生物学功能的影响45-61
• 前言45
• 2.1 材料与设备45-47
• 2.2 方法47-52
• 2.3 结果52-58
• 2.4 讨论58-61
• 第三章 miR-125a-3p与MTA1在NSCLC组织中的表达相关性61-66
• 前言61
• 3.1 材料与设备61-62
• 3.2 方法62-63
• 3.3 结果63-64
• 3.4 讨论64-66
• 参考文献66-72
• 全文小结72-73
• 研究生期间成果73-74
• 致谢74-75

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 潘请;丁丁;马筱玲;;miR-125家族与肿瘤的相关性研究进展[J];国际检验医学杂志;2015年04期

2 范忠义;焦顺昌;;Mir-125a与相关疾病关系的研究进展[J];解放军医学院学报;2015年11期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 林毅;血管生成素样蛋白3及不同结构域影响足细胞骨架重排的机制研究[D];复旦大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 游志峰;肺腺鳞癌组织中miRNA表达谱的变化与放疗敏感性的关系[D];中南大学;2014年

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本文编号：529538