CENPF的表达对前列腺癌临床进展及预后的预测意义

发布时间：2017-07-13 16:25

  本文关键词：CENPF的表达对前列腺癌临床进展及预后的预测意义

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【摘要】：研究背景和目的：作为男性群体中最常见的肿瘤之一,前列腺癌是西方国家中死亡率第二高的肿瘤。在世界范围内,每年有超过90万人被诊断为新发的前列腺癌。2014年美国男性新发的肿瘤中有大约有24%的患者被确诊为前列腺癌患者。目前中国人群中前列腺癌的发生率及死亡率也在逐步上升。前列腺癌作为一种多因素、多病灶的临床疾病,其自然病程变化较大且难以预测。影响前列腺的进展和预后的机制是一个多步骤的复杂过程,既包括上皮细胞的基因受损因素,也包括上皮细胞与间质的相互作用的改变。由于外科技术的发展创新及手术后并发症的发生率的减少,许多原位前列腺癌患者在接受前列腺癌根治术后仍有较长期的生存率。然而,在接受前列腺癌根治术的患者中,大约有20%的患者在术后会出现生化复发且需要更进一步的治疗,并且目前对于手术治疗、放射治疗、化疗和激素治疗后发生生化复发及转移的前列腺癌,仍缺乏有效的治疗方法。临床上包括PSA水平、Gleason评分、肿瘤边缘恶性程度及对初始治疗的反应性等多个临床指标通过不同的组合形成不同的参数,都已经被用于预测前列腺癌的发展和预后,但仍然没有一种公认临床方法能准确地诊断肿瘤及预测患者术后复发、预后。因此,在肿瘤的生物基础层面上找寻新颖、有效的生物学标记为前列腺癌的进展预测提供有价值的信息就显得尤为重要了。尽管在探索前列腺癌高危因素及易感基因(就像BRC1/BRC2是乳腺癌及卵巢癌的易感基因)领域取得的成果有限,目前的研究还是找到了一批与前列腺癌发生、发展相关的基因并对之进行了相应的阐述,例如1号染色体及X染色体上基因的扩增就曾被报道与肿瘤的发生、发展相关。细胞周期进展(Cell cycle progression,CCP)评分是挑选出来的31个CCP基因在临床样本中RNA表达水平整合而成的肿瘤预后评分,该评分已经被证实可以有效地预测前列腺癌患者的临床预后。而CENPF正是定位于1号染色体长臂4区1带、属于31个CCP之一的基因,它编码的蛋白参与构成着丝粒并且在分裂间期的G2期中构成核基质的一部分,它的表达随着细胞周期改变并且影响到染色体的分离,其表达量在细胞周期开始时逐渐增加,到G2/M期达到峰值,当有丝分裂完成时则迅速下降。由于CENPF的功能与在细胞中的定位与细胞周期密切相关,所以既往的研究都认为该基因也许可以作为细胞分裂和恶性细胞增值、分化的指标。越来越多的研究证实CENPF基因参与到人类癌症的发生发展当中,例如乳腺癌、肝细胞癌、结直肠、胃肠道间质瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、腮腺癌等等。且肝癌、乳腺癌、胃肠道间质肿瘤、鼻咽癌等肿瘤的不良临床预后与CENPF的过表达密切相关。然而,CENPF在前列腺癌中临床意义还没有无详细报道。本研究通过应用免疫组织化学分析前列腺癌组织及非癌组织中CENPF蛋白水平,并在基因芯片数据库——Taylor数据库(NCBI GEO accession:GSE21032)中对CENPF基因的RNA水平进行进一步分析和验证,进而对CENPF表达水平与前列腺癌患者的临床病理特征之间的关联进行数据统计分析,最终探索CENPF与前列腺癌患者肿瘤进展、预后之间的联系。实验材料：为了在前列腺癌患者中找到确定与肿瘤进展及诊断有关的候选基因,我们在包含microRNA和蛋白编码基因mRNAs的基因表达数据库(NCBI GEO accession no:GSE21032;该数据库包括185例临床样本和细胞株相应的microRNA及mRNA的表达谱芯片数据)中利用统计学方法分析、评估生化复发密切相关的31个CCP基因对前列腺癌生化复发的诊断价值,从统计结果中挑选研究的目标基因。同时收集数据库中150名前列腺原位癌和29名前列腺癌旁组织的临床相关信息,用于后续的统计分析。免疫组化分析使用组织芯片购自上海(Shanghai Outdo Biotech Co, LTD (Cat No:HPro-Ade180PG-01),该芯片包含99例前列腺原位癌组织及81例前列腺癌旁组织,附带患者相应的临床信息,且所有患者术前均没有接受过化疗及放疗。实验方法：免疫组化分析：临床标本保存在在10%中性福尔马林中,随即石蜡块包埋,然后组织被切成厚度为4um的切片,二甲苯脱蜡后水化使之能够进行免疫组化DAB染色(染色使用DAKO EnVision System (Dako Diagnostics, Switzerland).简短地进行蛋白酶消化和过氧化物酶阻断后,按1：200的比例稀释一抗(rabbit polyclonal antibody, bs-7839R, BEIJING BIOSYNTHESIS BIOTECHNOLOGY Co. Ltd., China),将稀释后的一抗孵育切片,4℃C过夜。次日,洗净切片,用过氧化物标记的多聚物及色原体基质处理以发现目标蛋白的染色情况,在整个免疫组化实验中,空白对照不加一抗处理。在苏木素复染后,两位有经验的病理实验工作者各自独立对组织的免疫染色进行评分,且这两位工作者对患者的临床病理报告及预后完全不知情。随后对两组评分数据进行比较,任何有差异评分的切片都要进行重新评估,当两位工作人员的评分一致时,癌细胞的免疫标记评估才完成。具体评分方法如下：(取十个典型的显微镜下视野并数出阳性染色细胞数,计算出阳性细胞比例,根据抗体说明书,细胞质染色即为阳性(由于目标蛋白染色的异质性,对肿瘤切片评分采取半定量的方式。根据染色细胞的比例(0-100%)及染色的深度(0-阴性、1-弱阳性、2-中等阳性、3-强阳性)来评定每一个肿瘤组织切片目的蛋白表达水平。染色细胞比例评分及染色深度评分相乘构成了最终的免疫组化评分(immunoreactivity score, IRS).统计学处理：所有实验数据均用均数±标准差表示,数据统计分析用SPSS 17.0统计软件包(SPSS Inc, IL, USA)处理。独立样本T检验结果用X±s表示,所有2×2表格进行Fisher精确检验,对非2×2进行Pearson卡方检验,使用Kaplan-Meier方法和Log-rank检验进行生存分析,Cox危险因素回归模型用于分析单因素和多因素的生存分析,当P值小于0.05时认为差异具有统计学意义。结果：1.从CCP基因群中挑选出CENPF由于31个CCP基因的表达量是基于RNA水平,因此这一批基因可能代表着前列腺癌基础医学方面,也能够为临床预后提供有价值的信息。我们在Taylor数据库中用Kaplan-Meier plots分析了这31个CCP基因,结果显示其中10个表达上调的基因和生化复发相关。在这10个基因中,CENPF可能可以作为恶性肿瘤细胞分化的指标,而与此同时,既往研究也报道了该基因也与人类多种癌症的不良预后密切相关。2. CENPF蛋白在前列腺癌临床标本中表达上调我们首先分析了实验所用的组织芯片(TMA)数据来明确CENPF是否与临床切片有关联,我们用免疫组化分析了CENPF蛋白在TMA中的表达量及其在99例前列腺癌和癌旁组织中的定位。结果显示CENPF蛋白主要表达在癌组织的胞质,而在癌旁组织不表达或只是中等表达,并且CENPF蛋白在前列腺癌组织中的表达量明显高于非癌组织(免疫组化评分(IRS):PCa=177.98±94.096,Benign=121.30±89.596,P0.001),值得一提的是,在进行免疫组化评分时,我们发现CENPF蛋白也在癌细胞间质中强表达,而在良性前列腺组织的间质中则为中等表达,对组织芯片中的间质中的CENPF的免疫染色也进行分析发现间质中的CENPF表达量与临床信息没有相关性。3. CENPF的mRNA表达量与前列腺癌临床病理特征之间的联系在我们的组织芯片中,尽管在蛋白水平CENPF的表达增加与临床临床病理特征无明显相关性,我们想进一步探索CENPF在mRNA水平的表达。与蛋白水平相似,CENPF在前列腺癌组织中的mRNA表达量也明显高于非癌组织(PCa=5.67 ±0.47 vs. Benign=5.40±0.11, P0.001。更重要的是,Taylor数据库表明CENPF的表达量增加与高Gleason评分(P=0.005),高病理等级(P=0.008),肿瘤转移的出现(P0.001),更短的生存时间(P=0.003),生化复发(P0.001)都密切相关,这些基本信息都指向CENPF和前列腺癌的临床预后存在紧密的联系。且与中等Gleason评分(GS=7)及低Gleason评分(GS=6)的组织相较,Gleason评分≥8分的组织中CENPF的表达量明显增高(P值分别为0.02、0.013),但是中等Gleason评分组与低Gleason评分组中的CENPF表达无明显差异。4. CENPF表达量对于前列腺诊断价值的描述在Taylor数据库中我们使用Kaplan-Meier图表分析前列腺癌患者总体生存率及生化复发时间与CENPF表达量之间的联系。以CENPF表达量的中位数为分割点将前列腺癌组织分为高表达组(65例)和低表达组(75例),CENPF高表达组和低表达组在前列腺癌总体生存率上没有明显区别,但在生化复发时间上,高表达组明显比低表达组更早地出现了生化复发。在单因素分析中高表达组与低表达组在生化复发时间上也表现出明显差异(HR 3.384,95% CI 2.066-5.541; P0.001)。此外,在多因素分析结果中,表达上调的CENPF (HR 4.251,95% CI 1.372-13.167; P=0.012)、高Gleason评分(HR 2.624,95% CI1.671-4.119：P0.001)、术前高PSA水平(HR 1.005,95% CI 1.001-1.01; P=0.02)都是生化复发独立的预测因子。结论：1. CENPF可能起着促癌的作用,根据其mRNA和蛋白表达的差异,可鉴别前列腺癌及前列腺良性组织。2. CENPF的表达上调与前列腺癌的疾病进展密切相关,可以通过检测它在前列腺组织的水平高低,初步预测前列腺癌的恶性程度及判断前列腺癌的术后预后。3.前列腺组织间质中CENPF表达上调越明显,则前列腺癌患者临床预后越差。CENPF在前列腺癌组织中的上调表达可作为预测人类前列腺癌患者的不良临床预后的指标提供了证据。4. CENPF可能通过调节肿瘤细胞的染色体分裂稳定性及细胞周期蛋白等而影响前列腺癌的发展及预后。5.通过分析前列腺癌患者CENPF的表达情况,可预测早期生化复发的概率,为临床医生提供有效信息,帮助制定个性化的治疗方案
【关键词】：前列腺癌 centromere protein F 临床病理特征 生化复发 预后
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第1章 前言18-44
• 1.1 前列腺癌的流行病学概述18-20
• 1.2 前列腺癌的发病机理20-23
• 1.2.1 肿瘤的分子生物学基础及其特征20-21
• 1.2.2 前列腺癌发生、发展的分子机制21-23
• 1.3 前列腺癌的临床诊疗进展23-32
• 1.3.1 前列腺癌的临床诊断23-26
• 1.3.2 前列腺癌的临床分期26-28
• 1.3.3 前列腺癌的临床治疗进展28-30
• 1.3.4 前列腺癌术后的生化复发30-32
• 1.4 细胞周期进展(Cell cycle progression,CCP)基因研究进展32-39
• 1.4.1 CCP的发现32-33
• 1.4.2 CCP与人类肿瘤的关系33-34
• 1.4.3 CCP在前列腺癌中的研究34-39
• 1.5 CCP中着丝粒蛋白(centromere protein F,CENPF)的研究39-43
• 1.5.1 CENPF的发现39-41
• 1.5.2 CENPF与人类肿瘤的研究进展41-43
• 1.6 本研究拟解决的问题43-44
• 第2章 实验材料与方法44-50
• 2.1 实验材料44-46
• 2.1.1 免疫组化组织标本收集44
• 2.1.2 统计数据库组织标本收集44-45
• 2.1.3 临床病例纳入标准、排除标准45
• 2.1.4 临床样本病理资料及随访45-46
• 2.1.5 实验主要试剂46
• 2.1.6 实验主要仪器46
• 2.2 实验方法46-48
• 2.3 前列腺癌基因芯片数据库(Taylor数据库)48-49
• 2.4 统计学处理49-50
• 第3章 结果50-55
• 3.1 从CCP基因群中挑选出CENPF50
• 3.2 CENPF蛋白在前列腺癌临床标本中表达上调50-52
• 3.3 CENPF的mRNA表达量与前列腺癌临床病理特征之间的联系52-53
• 3.4 CENPF表达量对于前列腺癌预后诊断价值53-55
• 第4章 讨论55-60
• 4.1 CENPF在前列腺癌诊疗中的临床意义55-56
• 4.2 CENPF在肿瘤及前列腺癌中的异常表达56-57
• 4.3 CENPF对前列腺癌肿瘤的潜在调节作用57-60
• 第5章 结论60-61
• 本研究的不足之处61-62
• 参考文献62-70
• 缩略词表70-72
• 攻读学位期间发表的论文72-73
• 致谢73-74

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王永潮;彭安;梁，

本文编号：537627