慢病毒介导CCDC67转染甲状腺乳头状癌细胞生物学活性的鉴定

发布时间：2017-07-18 22:12

  本文关键词：慢病毒介导CCDC67转染甲状腺乳头状癌细胞生物学活性的鉴定

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【摘要】：背景和目的:甲状腺癌是头颈部的恶性肿瘤,是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,在所有恶性肿瘤中约占3%,在女性中发病率较高。甲状腺癌中最常见的病理类型是乳头状癌,在甲状腺癌中占约90%,其发生率呈逐年上升的趋势。虽然对甲状腺癌变的研究已经取得了一定的进展,但其具体癌变机制仍需进行深层次地探索。肿瘤的发生和发展是多因素、多阶段、多基因改变的病理过程。基因突变、基因重组、癌基因的激活、表观遗传学的改变、抑癌基因的失活等在癌变过程中发挥重要作用,而抑癌基因在转录水平和基因组的异常表达是肿瘤发生的常见原因之一。研究表明如果将失活的抑癌基因重新表达,恢复其功能,将会对肿瘤细胞的生长起到抑制作用。最近的研究表明卷曲螺旋结构域67(CCDC67)是一个新的候选抑癌基因,且与肿瘤形成的细胞信号传导有关,研究发现CCDC67m RNA在肺癌、宫颈癌、乳腺癌等恶性肿瘤中发现其表达缺失或降低。但有关甲状腺癌中CCDC67基因的表达及其临床资料很少有报道。因此,我们运用RT-PCR检测CCDC67m RNA在甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)中的表达情况,Western blot检测CCDC67蛋白在PTC中的表达情况,并分析其与临床病理的相关性。接着采用慢病毒介导稳定转染甲状腺乳头状癌细胞,使CCDC67在细胞中过表达,分析转染前后甲状腺乳头状癌细胞的生物活性,鉴定CCDC67的基因功能,以此评判CCDC67基因是否是PTC的抑癌基因,为肿瘤的治疗提供新的契机。材料与方法:1、采用RT-PCR及Western blot检测56例PTC肿瘤组织及其与癌灶相隔2cm以上的非癌上皮(non-carcerous epithelium,NCE)组织中CCDC67基因的转录及翻译情况,并分析其与临床病理的相关性。2、运用RT-PCR、Western blot检测甲状腺癌细胞系TPC-1、SW579中CCDC67基因表达的情况。3、CCDC67基因慢病毒表达载体的构建及鉴定。4、构建慢病毒载体介导CCDC67过表达TPC-1细胞,通过侵袭迁移实验、平板克隆实验、流式细胞技术检测细胞周期、凋亡、CCK-8、划痕实验检测转染前后TPC-1细胞生物学活性。5、采用SPSS17.0统计软件进行数据分析,两样本率的比较用四格表资料的卡方检验,多样本均数的比较采用单因素方差分析,两样本定量资料采用t检验,以P0.05为差异具有显著统计学意义。结果1、56例癌旁组织中均出现CCDC67m RNA和蛋白的表达。PTC组织中有41.4%(23/56)出现CCDC67m RNA的表达,与患者的TNM分期、病理分级及淋巴结转移有关(P0.05),有46.4%(26/56)出现CCDC67蛋白的表达,且与患者的TNM分期、病理分级及淋巴结转移有关(P0.05)。2、在甲状腺癌细胞系中,TPC-1、SW579细胞中CCDC67的表达均缺失。3、PCR产物经电泳分析表明成功获取CCDC67基因c DNA克隆,测序结果显示慢病毒转染质粒连接构建正确。荧光表达检测显示293T细胞中产生慢病毒颗粒,Western blot显示CCDC67在细胞内稳定表达,证实成功构建CCDC67基因慢病毒表达载体。4、通过慢病毒介导CCDC67过表达TPC-1细胞,转染后TPC-1细胞的生物学活性受到抑制。结论:1、在甲状腺癌细胞系以及甲状腺乳头状癌组织标本中均检测到CCDC67基因m RNA以及蛋白表达的缺失,初步证实CCDC67是甲状腺乳头状癌的候选抑癌基因。2、慢病毒可以感染TPC-1细胞系,并且CCDC67基因可以在TPC-1细胞中稳定过表达。3、慢病毒介导CCDC67转染TPC-1细胞后,能明显促使TPC-1细胞株恶性表型的逆转,进一步证实CCDC67为PTC的一个抑癌基因。
【关键词】：CCDC67 甲状腺乳头状癌 TPC-1 慢病毒载体
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R736.1
【目录】：

• 摘要4-7
• abstract7-12
• 缩略词表12-13
• 前言13-16
• 第一部分 甲状腺癌组织标本以及甲状腺乳头状癌细胞中CCDC67的表达16-29
• 1.材料和仪器16-18
• 2.实验方法18-23
• 3.结果23-27
• 4.讨论27-28
• 5.结论28-29
• 第二部分：构建CCDC67重组慢病毒表达载体并鉴定其在甲状腺乳头状癌细胞中过表达29-42
• 1.材料和仪器29-30
• 2.实验方法30-37
• 3.结果37-40
• 4.讨论40-41
• 5.结论41-42
• 第三部分CCDC67基因过表达对TPC-1 细胞生物学功能的影响42-55
• 1.材料和仪器42-43
• 2.实验方法43-45
• 3.结果45-53
• 4.讨论53-54
• 5.结论54-55
• 全文总结55-56
• 参考文献56-59
• 综述59-71
• 参考文献68-71
• 个人简介71-72
• 致谢72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 孙克宁;朱化彬;林峰;王栋;郝海生;杜卫华;赵学明;;慢病毒载体的构建及其应用于转基因动物的研究进展[J];中国畜牧兽医;2010年08期

2 黄黎珍;刘光泽;顾为望;;慢病毒载体法制备转基因动物研究进展[J];实验动物与比较医学;2007年01期

3 魏香,曾宪纲,周海梦;蛋白质结构中卷曲螺旋的研究进展[J];中国生物化学与分子生物学报;2004年05期

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本文编号：560016