Drosha沉默对胃癌细胞迁移影响及其分子机制研究

发布时间：2017-07-19 15:25

  本文关键词：Drosha沉默对胃癌细胞迁移影响及其分子机制研究

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【摘要】：第一部分Drosha沉默对胃癌细胞生物学行为的影响目的:探讨胃癌细胞中沉默Drosha表达对细胞生物学功能的影响方法:设计靶向Drosha的干扰序列并重组到慢病毒载体,建立Drosha基因沉默的稳定细胞株,通过Real-time PCR和Western blot验证Drosha在m RNA及蛋白水平上的干扰情况;分别采用甲基噻唑基四唑(MTT)方法、划痕实验、Transwell实验、流式细胞术检测稳定细胞株的增殖、迁移、凋亡及对表阿霉素敏感性的变化。结果:成功构建稳定干扰Drosha表达的细胞株,且同阴性对照组相比,干扰Drosha表达后对细胞周期和细胞凋亡无明显影响;经表阿霉素处理对照组及干扰组细胞24h后,流式细胞术结果显示,干扰Drosha组细胞凋亡率(78.8±1.9)%明显高于对照组(59.22±1.0)%,差异具有统计学意义(P0.05);经表阿霉素处理后,在干扰Drosha组中凋亡相关的蛋白caspase3、caspase9、Bax表达明显上调,而抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低。划痕实验、Tranwell实验结果证实敲低Drosha表达后细胞迁移能力降低,结论:在胃癌细胞中沉默Drosha表达对细胞增殖周期及凋亡无明显影响,但能降低癌细胞的迁移能力及提高细胞对表阿霉素的敏感性。第二部分Drosha对胃癌细胞迁移影响分子机制研究目的:探讨沉默Drosha表达对胃癌细胞迁移影响的具体分子机制方法:分别提取Drosha稳定沉默及对照组细胞中总RNA,进行micro RNA芯片检测并筛选差异mi RNA。生物信息学网站预测差异mi RNA靶基因,通过DIVID软件将靶基因进行KEGG-pathway富集分析;结合文献及信号通路分析选择与细胞迁移相关的靶基因,并通过芯片数据及网站预测筛选出调控靶基因的差异mi RNA;采用荧光素酶报告基因及q RT-PCR实验验证靶基因受相应差异mi RNA的调控;通过q RT-PCR和Western blot的方法检测靶基因在稳定沉默Drosha表达细胞中的情况;Kaplan生存曲线分析靶基因与胃癌预后的关系,运用免疫组化方法及q RT-PCR实验检测靶基因在胃癌组织中的表达,Western blot检测靶基因在各细胞株中的表达;分别在野生型及沉默Drosha表达的MGC-803细胞中干扰和过表达靶基因,通过Transwell实验验证不同组MGC-803细胞中迁移能力的变化情况,Weatern blot检测靶基因下游与迁移相关蛋白的活化情况。结果:Drosha敲低后引起61个micro RNAs表达发生变化(变化倍数大于2),其中47个下调和14个上调;KEGG富集分析显示靶基因参与ECM受体、p53、MAPK信号通路等的调控;结合文献选择与迁移相关的靶基因为LAMC2和CD82,荧光素酶报告基因及q RT-PCR实验证实mi RNA-622和mi RNA-197分别靶向调控LAMC2和CD82;且在芯片数据中mi RNA-622表达上调,mi RNA-197表达下调;在敲低Drosha表达的MGC-803及NUGC-3细胞中,LAMC2 m RNA及蛋白表达水平下降,而CD82在m RNA及蛋白水平上表达增高;Kaplan生存曲线分析表明LAMC2高表达患者生存率低而CD82高表达患者生存率明显高于对照组;与癌旁组织相比LAMC2在癌中高表达而CD82在癌组织低表达;在Drosha沉默表达的MGC-803细胞中过表达LAMC2基因促进了细胞迁移、而在野生型MGC-803细胞中过表达CD82则抑制胃癌细胞迁移能力;Western blot结果显示差异表达的LAMC2和CD82能抑制下游EGFR-ERK1/2及MMP7信号通路的活化。结论:Drosha沉默引起mi RNA-622和mi RNA-197差异表达,并分别通过靶向调控LAMC2和CD82抑制EGFR-ERK1/2及MMP7信号通路的活化,降低了胃癌细胞迁移能力。
【关键词】：Drosha基因 胃癌 生物学功能 Drosha micro RNA 迁移 LAMC2 CD82
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 第一部分Drosha沉默对胃癌细胞生物学行为的影响12-30
• 前言12-13
• 1 材料与方法13-22
• 2 结果22-27
• 3 讨论27-28
• 参考文献28-30
• 第二部分Drosha沉默对胃癌细胞迁移影响的分子机制研究30-39
• 前言30-31
• 1 材料与方法31
• 2 结果31-37
• 3 讨论37-39
• 参考文献39-41
• 全文总结41-42
• 文献综述42-49
• 参考文献46-49
• 致谢49-50
• 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文50

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本文编号：563594