EZH2调控人头颈部鳞癌生长的实验研究

发布时间：2017-07-20 16:17

  本文关键词：EZH2调控人头颈部鳞癌生长的实验研究

  更多相关文章： EZH2 DZNEP MICU1 细胞凋亡 肿瘤生长 人头颈部鳞状细胞癌

【摘要】：近年来,头颈部鳞癌的患病率逐渐增加。且头颈部鳞癌患者的病情进展较快,治疗效果及预后均不理想。尽管对于头颈部鳞癌的诊断与治疗方面已经有了明显的发展与突破,但是每年死于头颈部鳞癌的患者仍很多。因此研究头颈部鳞癌细胞的生长,寻找头颈部鳞状细胞癌新的有效治疗靶点是当前改善头颈部鳞癌患者治疗效果的重要突破口。Zest同源增强子(EZH2)是组成多梳蛋白PRC2复合物的核心亚基,它可以催化组蛋白H3K27三甲基化介导其下游靶基因转录沉默,其中肿瘤的发生与发展过程中尤为重要。EZH2如何调控肿瘤细胞凋亡的报道并不多,对于EZH2影响头颈部鳞状细胞癌细胞凋亡和肿瘤生长的报道更属空白。线粒体钙离子摄入蛋白1(MICU1)是线粒体依赖性死亡途径的负调控因子。本文采用通过采用EZH2的小分子抑制剂DZNEP抑制头颈部鳞癌细胞表达及功能作用,另外还选取MICU1的表达及干扰质粒改变HNSCC细胞中MICU1的表达水平,对EZH2调控细胞凋亡以及肿瘤生长的作用效果和机制进行了以下体内外实验研究。研究共分为三部分:第一部分:对天津医科大学肿瘤医院的97例不同级别与分期的HNSCC组织标本提取蛋白,运用免疫组化染色法检测组织标本切片中EZH2的定位及表达情况。结合癌症基因组图谱(TCGA)的生存分析研究HNSCC中EZH2表达水平与HNSCC不良预后的相关性。采用Western blot方法检测5个HNSCC细胞系EZH2及MICU1蛋白的表达情况。第二部分:MTT法测定DZNEP对两舌癌细胞的半数致死量(IC50)及对细胞活性的抑制能力;平板克隆实验检测DZNEP对单个细胞的克隆形成能力的影响;Western blot检测细胞株DZNEP处理后相关蛋白的表达变化。流式细胞术检测细胞凋亡比率以及细胞周期的分布情况;β-半乳糖苷酶染色法检测抑制EZH2的表达后HNSCC细胞的衰老数目变化;JC-1荧光探针检测HNSCC细胞中EZH2受到抑制后线粒体膜电位的丧失情况;钙离子荧光探针检测HNSCC细胞中EZH2受到抑制后细胞浆内钙离子的浓度变化;Western blot分别检测细胞凋亡、周期相关蛋白及MICU1的表达变化。以上实验研究抑制EZH2的表达水平后,HNSCC细胞体外生长受到抑制的效果。为进一步探究EZH2/MICU1调控线粒体死亡通路影响肿瘤生长的机制。选用MICU1 Sh RNA敲低两个HNSCC细胞系中的MICU1水平;流式细胞术检测细胞凋亡的比例;钙离子荧光探针检测HNSCC细胞中MICU1受到抑制后细胞浆内钙离子的浓度变化,JC-1荧光探针检测HNSCC细胞中MICU1受到抑制后线粒体膜电位的丧失情况,Western blot分别检测凋亡相关蛋白及MICU1的表达变化。同时选用MICU1过表达质粒(GV230-MICU1)升高Hep-2的MICU1的水平,检测其凋亡变化。第三部分:建立HNSCC Cal27裸鼠皮下荷瘤动物模型,瘤内注射DZNEP,密切观察肿瘤生长情况,免疫组化检测HNSCC生长相关蛋白的变化情况,检测肿瘤组织凋亡比率,进一步验证体外的实验结果。结果:97例标本的免疫组化结果显示,在HNSCC中EZH2处于高表达状态,并且级别越高EZH2的表达水平越高,并且其预后较差。实验结果显示在5种细胞系中Cal27和SCC25中EZH2和MICU1的表达均相对较高。Cal27、SCC25细胞DZNEP的IC50分别为6和3μmol/L。体外实验结果表明,DZNEP处理后,能够明显抑制细胞的活性,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡及衰老;EZH2表达水平的改变破坏了细胞线粒体膜电位的稳定性;钙离子探针检测细胞内Ca2+浓度明显增加;Western blot结果表明示MICU1的表达明显受到DZNEP的抑制。敲低MICU1的表达水平后,细胞早期凋亡比率增高;细胞内Ca2+浓度显著升高;线粒体膜电位水平丧失;凋亡相关蛋白的变化与抑制EZH2表达后变化一致。体内实验观察结束时,DZNEP处理组裸鼠荷瘤体积明显小于其各自的无义对照组,肿瘤质量明显低于对照组。免疫组织化学染色结果示,DZNEP组中BAX、Cleaved Caspase-3表达水平增加,抗凋亡蛋白的表达水平受到抑制;TUNEL结果显示,DZNEP能够诱导体内肿瘤细胞凋亡凋亡。体内外实验结果一致。结论:1.EZH2在头颈部鳞癌标本中高表达提示患者预后不良。2.DZNEP可以通过抑制EZH2的功能作用,进而抑制MICU1的表达水平,参与调控头颈部鳞癌细胞线粒体途径凋亡。3.DZNEP可以抑制人HNSCC细胞Cal27裸鼠荷瘤模型的生长;EZH2的抑制剂将可能成为HNSCC新的治疗靶点。
【关键词】：EZH2 DZNEP MICU1 细胞凋亡 肿瘤生长 人头颈部鳞状细胞癌
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.91
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语/符号说明12-13
• 前言13-16
• 研究现状、成果13-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、EZH2在头颈部鳞癌中高表达且提示患者预后不良16-23
• 1.1 对象和方法16-18
• 1.1.1 实验对象及材料16
• 1.1.2 实验方法16-17
• 1.1.3 统计学分析处理17-18
• 1.2 结果18-20
• 1.2.1 头颈部鳞癌组织标本中EZH2的表达及定位18-19
• 1.2.2 TCGA数据分析EZH2与头颈部鳞癌的生存与肿瘤级别的关系19-20
• 1.3 讨论20-22
• 1.4 小结22-23
• 二、抑制EZH2及MICU1影响头颈部鳞癌细胞生长的体外研究23-53
• 2.1 对象和方法23-29
• 2.1.1 实验对象及材料23-24
• 2.1.2 实验方法24-29
• 2.1.3 统计学处理29
• 2.2 结果29-50
• 2.2.1 Wstern blot检测头颈部鳞癌细胞系中EZH2等蛋白的表达水平29-30
• 2.2.2 MTT法检测头颈部鳞癌细胞DZNEP半数抑制浓度IC50值30-31
• 2.2.3 Western blot法检测抑制EZH2后EZH2等蛋白的表达变化31-32
• 2.2.4 MTT法检测DZNEP对细胞增殖能力的影响32
• 2.2.5 流式细胞术检测DZNEP处理后对细胞周期的变化32-34
• 2.2.6 平板克隆法检测DZNEP处理后对细胞增殖能力的影响34
• 2.2.7 Western blot法检测DZNEP处理后细胞周期相关蛋白的变化34-35
• 2.2.8 流式细胞术检测抑制EZH2后对细胞凋亡率的变化35-37
• 2.2.9 β-半乳糖苷酶染色检测抑制EZH2后细胞衰老率的变化37-39
• 2.2.10 Western blot法检测抑制EZH2后细胞凋亡相关蛋白的变化39-40
• 2.2.11 JC-1 探针染色法检测抑制EZH2后细胞线粒体膜电位的变化40-42
• 2.2.12 钙离子探针法检测DZNEP处理后细胞钙离子浓度的变化42-43
• 2.2.13 检测能够有效敲低两细胞系MCIU1表达的质粒序列43-44
• 2.2.14 流式细胞术检测敲低MICU1后对细胞凋亡率的变化44-45
• 2.2.15 钙离子探针法检测敲低MICU1后细胞钙离子浓度的变化45-46
• 2.2.16 JC-1 探针染色法检测敲低MICU1后细胞线粒体膜电位的变化46-47
• 2.2.17 Western blot法检测敲低MICU1后细胞凋亡相关蛋白的变化47-48
• 2.2.18 流式细胞术检测过表达Hep-2 中MICU1后细胞凋亡率的变化48-49
• 2.2.19 Western blot法检测过表达MICU1后细胞凋亡相关蛋白的变化49-50
• 2.3 讨论50-52
• 2.4 小结52-53
• 三、EZH2抑制剂抑制裸鼠荷头颈部鳞癌细胞Cal27生长的体内研究53-60
• 3.1 对象和方法53-54
• 3.1.1 实验对象及材料53
• 3.1.2 实验方法53-54
• 3.1.3 统计学处理54
• 3.2 结果54-58
• 3.2.1 抑制剂DZNEP对裸鼠荷瘤生长的影响54-56
• 3.2.2 治疗后肿瘤相关指标变化情况56-57
• 3.2.3 TUNEL 法检测肿瘤组织凋亡57-58
• 3.3 讨论58-59
• 3.4 小结59-60
• 结论60-61
• 参考文献61-67
• 发表论文和参加科研情况说明67-68
• 综述68-77
• 综述参考文献72-77
• 致谢77-79
• 个人简历79

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