Nur77的SUMO化修饰在乳腺癌细胞中的功能

发布时间：2017-08-08 02:24

  本文关键词：Nur77的SUMO化修饰在乳腺癌细胞中的功能

  更多相关文章： Nur77 翻译后修饰 SUMO ERα 乳腺癌

【摘要】：细胞核受体家族成员的数目繁多,它们通过对下游因子的调控,在细胞内形成强大有序的调节网络。在细胞调节中,核受体家族成员大多受特异性配体激活,比较特殊的一类为孤儿核受体亚族,该亚族成员的配体未知或无需配体激活就能行使核受体功能。孤儿核受体家族NR4A (Nuclear receptor subfamily 4 group A)即属于后者,其中Nur77(即NR4A1)的作用广泛,多篇文献报道了Nur77在神经发育、刺激应答等多领域的核心作用。近年来,Nur77在癌症研究中的价值也开始显现,在前列腺癌、肺癌、膀胱癌等的研究中,Nur77的异常表达,能够影响癌症发生。乳腺癌细胞中,Nur77的表达量远高于正常的乳腺细胞,这种异常表达对乳腺癌的发生是否存在影响还尚未知晓。雌激素受体a (Estrogen receptor a, ERa)作为乳腺癌发病因子,是该病症研究的主要核心。由此,在判断Nur77对乳腺癌细胞影响的过程中,与ERa间的作用及联系将成为研究的重点。作为小蛋白类泛素化修饰的SUMO化修饰(Small ubiquitin-related modifer, SUMO)与泛素化修饰在对底物蛋白的识别和位点结合过程中都存在竞争性,能够极大地影响蛋白质的细胞内定位、稳定性等。上文提及的NR4A家族成员中另一成员Nurr1(即NR4A2)已经证实可以受SUMO化修饰,在结构和功能上具有保守性的同家族成员Nur77的相关研究尚未开展。综上,本研究重点在于Nur77作为ERα的辅激活因子促进乳腺癌细胞生长；同时,Nur77能被SUMO蛋白修饰,SUMO化对Nur77在乳腺癌细胞中的功能产生抑制作用。主要内容如下：1.通过对Nur77的氨基酸序列进行分析,赖氨酸K102和K557是潜在的SUMO化修饰位点。在Hela细胞中,通过免疫印迹和免疫共沉淀实验确定了Nur77是SUMO化修饰的底物。接下来的免疫荧光验证了两者在细胞中存在共定位。为了进一步确定Nur77的SUMO化修饰位点,采用定点突变的方式,构建了3种不同的点突变体,单突变K102R、K577R,双突变的2KR。后期的免疫共沉淀实验中,与野生型的Nur77相比,突变体K577与2KR都无法与SUMO发生共价性的相互作用,确定主要修饰位点是K577。2. Hela细胞中,通过免疫共沉淀和免疫荧光实验确定了ERa和Nur77间存在相互作用。接下来的荧光素酶报告基因实验中显示Nur77促进ERa的转录活性,并且呈剂量依赖性,推断Nur77是ERα的辅激活因子,促进乳腺癌细胞增殖。3.通过免疫荧光、荧光素酶报告基因、细胞增殖MTT和克隆形成实验,证明了SUMO化修饰对Nur77定位、转录活性都有影响,最终影响Nur77在ERa介导下对乳腺癌细胞增殖的促进作用。总之,本次研究将Nur77与雌激素受体联系起来,并且确认了该蛋白可以被SUMO蛋白修饰,扩展了Nur77的功能研究,为乳腺癌治疗提供了一个新的可能。
【关键词】：Nur77 翻译后修饰 SUMO ERα 乳腺癌
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 目录8-13
• 引言13-15
• 1 文献综述15-26
• 1.1 核受体超家族15-16
• 1.2 孤儿核受体Nur7716-20
• 1.2.1 简介与结构16-17
• 1.2.2 Nur77参与的细胞调节17
• 1.2.3 Nur77的翻译后修饰17-18
• 1.2.4 Nur77与癌症18-20
• 1.3 雌激素受体α20-22
• 1.3.1 简介与结构20-21
• 1.3.2 雌激素信号通路21-22
• 1.3.3 雌激素受体α与乳腺癌22
• 1.4 SUMO化修饰22-25
• 1.4.1 简介22
• 1.4.2 SUMO化修饰的过程22-24
• 1.4.3 SUMO化修饰的功能24
• 1.4.4 SUMO化修饰与疾病24-25
• 1.5 论文选题依据及研究内容25-26
• 1.5.1 选题依据25
• 1.5.2 研究内容25-26
• 2 Nur77的SUMO化修饰26-37
• 2.1 引言26
• 2.2 仪器与试剂26-28
• 2.2.1 仪器26-27
• 2.2.2 试剂27
• 2.2.3 菌种、细胞27-28
• 2.3 实验方法28-32
• 2.3.1 感受态细胞(DH5α)的制备28
• 2.3.2 转化28
• 2.3.3 提取质粒28-29
• 2.3.4 DNA琼脂糖凝胶电泳实验29
• 2.3.5 细胞培养29
• 2.3.6 细胞转染29-30
• 2.3.7 细胞裂解30
• 2.3.8 考马斯亮蓝法测蛋白浓度30
• 2.3.9 蛋白质免疫共沉淀30
• 2.3.10 SDS-PAGE电泳30-31
• 2.3.11 湿法转膜及曝光31-32
• 2.3.12 免疫荧光32
• 2.4 结果与分析32-36
• 2.4.1 Nur77的SUMO化位点软件分析32-33
• 2.4.2 Hela细胞中Nur77的SUMO化33-34
• 2.4.3 Nur77 SUMO化共价性修饰的确定34
• 2.4.4 Nur77与SUMO在细胞中的定位34-36
• 2.5 讨论36
• 2.6 小结36-37
• 3 Nur77的SUMO化修饰位点确定37-43
• 3.1 引言37
• 3.2 仪器与试剂37-38
• 3.2.1 仪器37
• 3.2.2 试剂37-38
• 3.2.3 菌种、细胞38
• 3.3 实验方法38-41
• 3.3.1 Nur77单位点突变体的构建38-39
• 3.3.2 Nur77双位点突变体的构建39-40
• 3.3.3 细胞培养40
• 3.3.4 细胞转染40
• 3.3.5 细胞裂解40
• 3.3.6 考马斯亮蓝法测蛋白质浓度40
• 3.3.7 蛋白质免疫共沉淀40
• 3.3.8 SDS-PAGE电泳40
• 3.3.9 湿法转膜及曝光40-41
• 3.4 结果与分析41-42
• 3.4.1 Nut77位点突变缺失体的表达41
• 3.4.2 Nur77的SUMO化修饰位点的确定41-42
• 3.5 讨论42
• 3.6 小结42-43
• 4 乳腺癌细胞中SUMO化修饰对Nut77功能的影响43-49
• 4.1 引言43
• 4.2 仪器与试剂43
• 4.2.1 仪器43
• 4.2.2 试剂43
• 4.3 实验方法43-45
• 4.3.1 细胞培养43
• 4.3.2 细胞转染43
• 4.3.3 细胞裂解43
• 4.3.4 荧光素酶报告基因实验43-44
• 4.3.5 细胞克隆体形成44
• 4.3.6 MTT细胞增殖实验44-45
• 4.4 结果与分析45-48
• 4.4.1 SUMO化影响Nur77对下游靶基因的调节45
• 4.4.2 SUMO化影响Nur77对下游靶基因的调节有剂量依赖性45-46
• 4.4.3 SUMO化修饰影响Nur77在乳腺癌细胞克隆形成中的功能46-47
• 4.4.4 SUMO化修饰影响Nur77在乳腺癌细胞增殖中的功能47-48
• 4.5 讨论48
• 4.6 小结48-49
• 5 Nur77与ERα间的相互作用及功能影响49-58
• 5.1 引言49
• 5.2 仪器与试剂49-50
• 5.2.1 仪器49
• 5.2.2 试剂49-50
• 5.3 实验方法50-52
• 5.3.1 细胞培养50
• 5.3.2 细胞转染50
• 5.3.3 细胞裂解50
• 5.3.4 考马斯亮蓝法测蛋白质浓度50
• 5.3.5 蛋白质免疫共沉淀50
• 5.3.6 SDS-PAGE电泳50
• 5.3.7 湿法转膜及曝光50
• 5.3.8 免疫荧光50
• 5.3.9 荧光素酶报告基因实验(E2刺激)50
• 5.3.10 反转录PCR50-52
• 5.3.11 DNA琼脂糖凝胶电泳实验52
• 5.4 结果与分析52-57
• 5.4.1 Hela细胞中Nur77与ERα间的相互作用52-53
• 5.4.2 Hela细胞中Nur77与ERα的亚细胞定位53-54
• 5.4.3 Nur77对ERα转录活性的影响54-55
• 5.4.4 Nut77对ERα转录活性的影响有剂量依赖性55-56
• 5.4.5 Nur77对ERα下游靶基因mRNA水平影响56-57
• 5.5 讨论57
• 5.6 小结57-58
• 6 乳腺癌细胞中SUMO化修饰影响ERα介导下Nur77的功能58-63
• 6.1 引言58
• 6.2 仪器与试剂58
• 6.2.1 仪器58
• 6.2.2 试剂58
• 6.3 实验方法58-59
• 6.3.1 细胞培养58
• 6.3.2 细胞转染58
• 6.3.3 细胞裂解58
• 6.3.4 荧光素酶报告基因实验58
• 6.3.5 细胞克隆体形成58-59
• 6.3.6 MTT细胞增殖实验59
• 6.4 结果与分析59-62
• 6.4.1 SUMO化影响Nur77对ERa转录活性的调节59
• 6.4.2 SUMO化影响ERα介导的Nur77在乳腺癌细胞克隆体形成中的功能59-61
• 6.4.3 SUMO化影响ERα介导的Nur77在乳腺癌细胞增殖中的功能61-62
• 6.5 讨论62
• 6.6 小结62-63
• 结论63-64
• 参考文献64-69
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况69-70
• 致谢70-71

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