miR-196a在肝细胞肝癌中的表达和促增殖作用研究

发布时间：2017-08-11 13:20

  本文关键词：miR-196a在肝细胞肝癌中的表达和促增殖作用研究

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【摘要】：肝癌的诊断和治疗仍是现今临床中难以解决的难题，传统的手术、放疗和化疗等方法对中晚期肝癌患者的疗效并不尽人意。因此，临床上亟待开发更为有效的治疗策略。随着肿瘤生物治疗技术的不断发展，基因治疗作为肝癌生物治疗的一个重要手段越来越受到临床医生的重视。大量的研究结果表明microRNA（miRNA）直接参与肝癌的发生和发展，并与肝癌的病理类型、恶性程度以及分级分期等临床病理特征密切相关。表明miRNA有可能成为肝癌的诊断和预后的标志物，而且可成为肝癌基因治疗的靶标。其中miR-196a在胰腺癌、宫颈癌、乳腺癌、胃癌和结肠癌等多种恶性肿瘤中表达上调，并通过抑制其靶基因p27、FOXO1、ING5、netrin4和IκBα等，从而促进恶性肿瘤的发生发展。但目前较少有人研究肝癌中miR-196a的表达水平和其下游调控的信号通路。本论文拟通过研究miR-196a在肝癌中的表达情况，进一步阐述miR-196a在肝癌细胞增殖过程中的生物学功能和具体分子机制。 目的：探讨miR-196a在肝癌组织的表达水平和对肝癌Hep3B细胞增殖的影响，阐明其促进肝癌细胞增殖的可能机制。 方法：收集20例肝癌及对应癌旁组织，培养肝癌HepG2、Hep3B和SMMC-7721细胞株以及人正常肝L02细胞株，采用qRT-PCR法分别检测miR-196a在肝癌和对应癌旁组织及肝癌和正常肝细胞中的表达水平，培养处于对数生长期的人肝癌Hep3B细胞株，在此基础上随机分为对照组和miR-196amimics及miR-196a inhibitors转染组，MTT检测转染后Hep3B细胞增殖活力，qRT-PCR法检测转染后Hep3B细胞miR-196a的表达，流式细胞术检测并用转染后Hep3B细胞周期，qRT-PCR和Western bloting法检测miR-196a潜在靶点叉头转录因子（FOXO1）的表达，免疫组化技术研究肝癌和对应癌旁组织FOXO1的蛋白表达水平。 结果：在肝癌组织中miR-196a的表达显著高于相应癌旁组织（P 0.05），miR-196a在人肝癌HepG2、Hep3B和SMMC-7721细胞中的表达水平明显高于人正常肝L02细胞（P 0.05）；与对照组比较，，miR-196a mimics转染人肝癌Hep3B细胞中miR-196a的表达水平明显升高（P 0.05），而miR-196a inhibitors转染人肝癌Hep3B细胞中miR-196a的表达水平明显降低（P 0.05）；与对照组比较，miR-196a通过促进G1/S期转换使Hep3B细胞增殖率升高（P 0.05）。与对照组比较，miR-196a mimics转染Hep3B细胞FOXO1蛋白和mRNA的表达水平明显降低（P 0.05），在肝癌组织中miR-196a与FOXO1表现出显著的负性相关。 结论：miR-196a通过抑制靶基因FOXO1的表达，从而促进肝癌细胞系的增殖，提示miR-196a可成为一个肝癌诊断和治疗的新靶点。
【关键词】：miR-196a 叉头转录因子FOXO1 肝癌 细胞增殖
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 文献综述13-22
• 2.1 肝癌的诊治现状13-15
• 2.1.1 肝癌的发病现状13
• 2.1.2 肝癌的发病机制13-14
• 2.1.3 肝癌的治疗现状14-15
• 2.2 miRNA 与肝癌15-19
• 2.2.1 miRNA15
• 2.2.2 miRNA 与肝癌增殖15-16
• 2.2.3 miRNA 与肝癌转移16-17
• 2.2.4 miRNA 与肝癌诊治17-19
• 2.3 miR-196a 与 FOXO119-22
• 2.3.1 miR-196a 与肿瘤19-20
• 2.3.2 FOXO1 与肝癌20-21
• 2.3.3 miR-196a 与 FOXO121-22
• 第3章 材料与方法22-36
• 3.1 实验材料和仪器22-27
• 3.1.1 肝癌组织标本22
• 3.1.2 肝细胞系22
• 3.1.3 主要药品和试剂22-23
• 3.1.4 仪器23-24
• 3.1.5 主要溶液的配置24-27
• 3.2 实验方法27-36
• 3.2.1 肝癌组织总 RNA 的提取27
• 3.2.2 细胞培养27-28
• 3.2.3 细胞转染及细胞增殖率检测28
• 3.2.4 细胞总 RNA 的提取28-29
• 3.2.5 总 RNA 的浓度的测定和鉴定29
• 3.2.6 逆转录 PCR 反应29-31
• 3.2.7 实时定量 RT-PCR（qRT-PCR）31-32
• 3.2.8 流式细胞术检测细胞周期32
• 3.2.9 细胞总蛋白的提取和 BSA 定量32-33
• 3.2.10 Western bloting 法检测 FOXO1 蛋白表达33-34
• 3.2.11 免疫组化分析34-35
• 3.2.12 统计学分析35-36
• 第4章 实验结果36-43
• 4.1 miR-196a 在肝癌组织和细胞中的表达水平显著上调36-37
• 4.2 验证 miR-196a mimics 和 miR-196a inhibitor 在 Hep3B 细胞中的转染效率37-38
• 4.3 miR-196a 对 Hep3B 细胞增殖的影响38-39
• 4.4 miR-196a 对 Hep3B 细胞周期的影响39-40
• 4.5 miR-196a 对 FOXO1 在 Hep3B 细胞中表达影响40-42
• 4.6 miR-196a 对 FOXO1 在肝癌组织中表达影响42-43
• 第5章 讨论43-46
• 结论46-47
• 参考文献47-56
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果56-57
• 致谢57

【共引文献】

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本文编号：656346