NSCLC淋巴内皮细胞异常增生的临床病理特征及机制探讨

发布时间：2017-08-11 13:28

  本文关键词：NSCLC淋巴内皮细胞异常增生的临床病理特征及机制探讨

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【摘要】：目的：1、探讨淋巴内皮细胞标志VEGFR2、VEGFR3、PROX1、LYVE1在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义；2、从肿瘤干细胞诱导分化角度进一步探讨NSCLC淋巴内皮细胞异常增生形成的可能机制。方法：1、临床研究：根据本研究要求筛选2012年1月1日至2012年12月31日在南京军区福州总医院行手术治疗的TxNOMO～TxN1MO非小细胞肺癌患者,采用免疫组织化学二步法对非小细胞肺癌术后组织淋巴内皮细胞标志VEGFR2、VEGFR3、PROX1、 LYVE1蛋白进行检测分析,同时收集患者的临床病理资料、随访患者的复发情况及其生存状态,计算无疾病生存时间(Disease-free survival, DFS)及总生存时间(Overall survival, OS)。计数资料采用Fisher精确检验,应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,预后多因素分析采用Cox多因素回归模型,Log-Rank检验设定P值0.05为差别显著。2、实验研究：(1)肿瘤干样细胞富集、筛选及鉴定：选用A549肺癌细胞株,利用顺铂化疗富集48h联合无血清条件培养法筛选培养2周后,采用CCK-8法、流式细胞仪分析技术、裸鼠成瘤实验鉴定筛选出来的肺癌干样细胞。(2)淋巴内皮细胞诱导分化：选择淋巴内皮细胞特殊培养基,将得到的肺癌干样细胞进行诱导分化。具体分为7组：A549组(RPMI1640培养基培养4周)、A549 CSLC组(无血清条件培养基培养4周)、肺癌干样细胞空白组1(淋巴内皮细胞培养基培养3周)、肺癌干样细胞空白组2(淋巴内皮细胞培养基培养4周)、肺癌干样细胞TNF-α组(淋巴内皮细胞培养基+TNF-α培养4周)、肺癌干样细胞VEGF-C组(淋巴内皮细胞培养基+VEGF-C培养4周)、肺癌干样细胞TNF-α+VEGF-C组(淋巴内皮细胞培养基+TNF-α+VEGF-C培养4周),采用Western Blot技术检测各组淋巴内皮细胞标志VEGFR2、VEGFR3、PROX1、LYVE1的表达情况。结果：1、按照筛选流程,共入组60例NSCLC患者。χ2检验统计结果显示：VEGFR2的表达与NSCLC患者的TNM分期(P=0.000)、是否有淋巴结转移(P=0.017)显著相关；VEGFR3的表达与NSCLC患者的TNM分期(P=0.000)、是否有淋巴结转移(P=0.000)显著相关;PROX1的表达与NSCLC患者的TNM分期(P=0.000)、是否有淋巴结转移(P=0.004)、分化程度(P=0.038)显著相关；LYVE1的表达与NSCLC患者的TNM分期(P=0.000)、是否有淋巴结转移(P=0.001)显著相关。2、采用Kaplan-Meier生存分析法分析NSCLC患者无疾病生存时间,结果表明：VEGFR2、VEGFR3、LYVE1及TNM分期对NSCLC患者的无疾病生存时间有影响(P=0.001)。然而,PROX1高表达似乎有更短的无疾病进展时间趋势,但并没有统计学差异。3、细胞增殖能力检测结果显示：相比A549细胞组,A549克隆球细胞组细胞增殖能力更强,两组对比差异有统计学意义(P0.05)。4、流式分析结果显示：富集后的A549克隆球细胞组干细胞表面标记物CD44的阳性率为64.16%、CD133的阳性率为70.88%；A549细胞组干细胞表面标记物CD44的阳性率为0.51%、CD133的阳性率为0.78%；两组差异有统计学意义(P0.05)。5、裸鼠成瘤实验结果显示：3周后接种105个A549克隆球细胞组的裸鼠皮下开始出现移植瘤,而接种105个A549细胞组的裸鼠在6周后才出现瘤体。饲养8周后,成瘤的裸鼠生长状态尚好,肉眼可明显观察到移植瘤形成,瘤体取出后测重量结果有统计学差异(P0.05)。6、蛋白印迹结果显示：与A549细胞组、A549克隆球细胞组相比,A549克隆球细胞经过淋巴内皮培养基诱导分化后的五组细胞,其淋巴内皮细胞标志VEGFR2、 VEGFR3、PROX1、LYVE1的表达明显升高,差异(P0.05)具有统计学意义；淋巴内皮细胞标志蛋白的表达与诱导分化的时间(肺癌干样细胞空白组1 vs较肺癌干样细胞空白组2)、是否加入淋巴内皮细胞诱导因子(肺癌干样细胞空白组2 vs肺癌干样细胞TNF-α组、肺癌干样细胞VEGF-C组、肺癌干样细胞TNF-α+VEGF-C组)密切相关,差异(P0.05)具有统计学意义；而淋巴内皮细胞标志蛋白的表达似乎与加入的诱导因子关系密切(肺癌干样细胞TNF-α组vs肺癌干样细胞VEGF-C组vs肺癌干样细胞TNF-α +VEGF-C组),但差异没有统计学意义(P0.05)。结论：1、淋巴内皮细胞标志VEGFR2、VEGFR3、PROX1、LYVE1的表达与患者的TNM分期、是否有淋巴结转移相关；VEGFR2、VEGFR3、LYVE1的高表达预示着更短的无疾病生存时间；2、顺铂化疗富集联合无血清悬浮培养法分离筛选肺腺癌干样细胞,其干细胞比例高,干性强,技术可行,可作为日后干细胞研究的基础方法;3、利用淋巴内皮细胞培养环境,肺腺癌干样细胞可以诱导分化为淋巴内皮细胞。
【关键词】：肺癌 肿瘤干样细胞 淋巴内皮细胞 分化
【学位授予单位】：福建中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 第一章 NSCLC淋巴内皮细胞异常增生的临床病理特征14-26
• 1. 研究的目的及意义14
• 2. 研究过程14-16
• 2.1 研究对象14
• 2.2 所需材料14
• 2.3 研究方法14-15
• 2.4 研究内容15
• 2.5 数据统计15-16
• 3. 结果16-24
• 3.1 NSCLC淋巴内皮细胞异常增生标志VEGFR2、VEGFR3、PROX1、LYVE1的表达16-19
• 3.2 VEGFR2、VEGFR3、PROX1、LYVE1的表达与NSCLC临床病理特征的相关性19-20
• 3.3 VEGFR2、VEGFR3、PROX1、LYVE1的表达与NSCLC预后的相关性20-24
• 4. 讨论24-25
• 5. 小结25-26
• 第二章 NSCLC淋巴内皮细胞异常增生形成的可能机制26-44
• 1. 研究的目的及意义26
• 2. 材料与方法26-34
• 2.1 实验材料26-28
• 2.2 实验方法28-34
• 3. 结果34-38
• 3.1 A549细胞在化疗富集联合无血清悬浮培养环境下的生长状态34
• 3.2 CCK-8法检测不同时间下A549细胞、A549克隆球细胞的增殖能力34-35
• 3.3 流式细胞仪技术检测A549细胞、A549克隆球细胞的干细胞表面标记物比较35-36
• 3.4 体内裸鼠成瘤实验比较A549细胞、A549克隆球细胞的裸鼠成瘤能力36-38
• 3.5 免疫印迹法检测A549克隆球细胞经诱导分化后相关蛋白的表达情况38
• 4. 讨论38-42
• 5. 小结42-43
• 结论43-44
• 参考文献44-47
• 附录47-48
• 致谢48-49
• 文献综述49-53
• 参考文献51-53
• 作者简历53

【参考文献】

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本文编号：656398