适体共轭的DNA四面体用于乳腺癌细胞的检测及阿霉素靶向输送初步研究

发布时间：2017-08-12 03:06

  本文关键词：适体共轭的DNA四面体用于乳腺癌细胞的检测及阿霉素靶向输送初步研究

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【摘要】：癌症是严重影响全人类健康和生命的严重疾病。在癌症的早期阶段对其进行准确的诊断并且及时采取有效的治疗措施是成功治疗癌症的关键因素。传统检测癌症的方法存在特异性差、灵敏度低、对病人造成伤害等缺点,难以满足肿瘤早期检测的要求,从而导致癌症的扩散和转移,错过治疗的最佳时机。近年来,系列针对肿瘤标志物的新型分子不断被开发出来,为肿瘤早期诊断的临床应用提供了新的机遇。另一方面,诊断出癌症后进行及时有效的治疗对提高病人的生存率具有十分重要的意义。其中,化疗是临床上最常用的治疗方法,但其存在溶解性差、细胞穿透性差、特异性差、毒副作用大和易产生多药耐药性等缺点。因此,构建高效的新型药物载体,以实现药物的高效靶向运输,提高药效,降低药物毒副作用,逆转肿瘤的多要耐药性是迫切需要的。适体由于具有高亲和力、高特异性、易化学合成与修饰、靶分子范围广泛等诸多优点,现已在肿瘤研究领域引起了广泛兴趣和关注。但单纯的适体稳定性较差,易受复杂的生理环境中的酶的降解。研究证明,将适体与纳米材料相连能够达到保护核酸适配体抗酶切的目的,同时也可为适体提供多价连接的平台。DNA纳米技术自提出以来,由于其具有结构可编程性、生物相容性好、无明显的细胞毒性和免疫刺激性等特点,在生物检测和药物运输领域引起了广泛的关注,尤其是在肿瘤的检测、成像及治疗中具有广泛的应用潜力。其中,DNA四面体作为一种尺寸小、结构稳定、易修饰的纳米结构,已经被广泛用于药物输送及生物传感器的设计中。多篇文献报道使用DNA四面体成功输送免疫刺激剂CpG、抗肿瘤药物阿霉素、小干扰RNA等进入细胞发挥作用,并取得了显著的效果。因此,DNA四面体被认为是一种安全、生物相容性好、稳定性高的高效生物载体。基于以上论述,本文构建了一种基于适体-DNA四面体的新型肿瘤检测和靶向药物运输系统,用于对乳腺癌细胞的灵敏检测和化疗药物的靶向输送。本论文共分为三章,对选题背景和意义,研究方法,研究取得的主要成果和结论进行阐述。对研究的应用和潜力做出了讨论。第一章为绪论部分,首先阐述了癌症的危害性以及癌症检测和治疗的重要性；介绍了传统的癌症检测和治疗的方法以及其存在的主要缺陷；此外还介绍了DNA纳米技术的发展以及其在肿瘤的诊断和治疗中的应用。第二章构建了适体-DNA四面体荧光探针用于乳腺癌细胞MCF-7的灵敏检测。该探针包括两个部分：1)能够特异性靶向乳腺癌细胞(MCF-7)表面MUC 1受体的适体作为识别单元,当遇到细胞膜表面MUC 1受体时,适体构象发生改变,将猝灭链置换下来,使得荧光恢复,实现"trun-on"的信号模式,当没有MUC 1存在时,探针构象不发生变化,荧光保持猝灭状态；2)DNA四面体结构作为探针多价连接的载体,同时能够增加探针的稳定性。通过在四面体的顶端直接延伸出适体序列将适体探针连接在DNA四面体上,探针通过“一锅法”反应合成,合成方法简单且产率较高。我们考察了连接不同数目的适体对检测MCF-7细胞的影响,并成功的将该探针用于MCF-7的灵敏检测中,实验证明其对MCF-7细胞具有良好的特异性,并且能够检测到最低300个细胞。第三章构建了细胞核靶向的适体-DNA四面体(AS 1411-A-Tetra)靶向药物运输系统。由于传统药物载体往往受到溶酶体的分解,将药物释放在细胞质而不是细胞核中,因此降低了药效,从而产生MDR。为了解决这个问题,我们在载药系统中连接能够靶向细胞核的适体,将药物直接运输至细胞核中,进一步避开P-gp介导的药物外排,以逆转肿瘤细胞多药耐药性。实验证明AS 1411-A-Tetra载药系统能够有效杀伤耐药细胞,在逆转多药耐药方面有很大的应用潜力。
【关键词】：
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-14
• 符号说明14-15
• 第一章 绪论15-31
• 1.1 引言15
• 1.2 肿瘤与癌症15-20
• 1.2.1 癌症概述15-16
• 1.2.2 癌症的诊断16-18
• 1.2.3 癌症的治疗18-20
• 1.3 适体及DNA纳米技术20-31
• 1.3.1 适体20-21
• 1.3.2 DNA纳米技术概述21-24
• 1.3.2.1 简单分支DNA纳米结构22
• 1.3.2.2 基于DNA瓦(DNA tile)的DNA纳米结构22
• 1.3.2.3 DNA折纸结构(DNA origami)22-24
• 1.3.3 DNA纳米技术用于癌症的检测24-26
• 1.3.4 DNA纳米技术用于癌症的治疗26-30
• 1.3.5 展望30-31
• 第二章 适体共轭的DNA四面体用于乳腺癌细胞的检测31-62
• 2.1 引言31-32
• 2.2 实验部分32-39
• 2.2.1 试剂32-33
• 2.2.2 仪器33-34
• 2.2.3 DNA的分装34
• 2.2.4 高温高压灭菌34
• 2.2.5 细胞复苏与冻存34-35
• 2.2.6 细胞培养与传代35
• 2.2.7 细胞的裂解35-36
• 2.2.8 玻片的处理36
• 2.2.9 适体-DNA四面体探针的合成36-37
• 2.2.10 适体-DNA四面体探针的凝胶电泳表征37
• 2.2.11 适体-DNA四面体探针细胞毒性的考察37-38
• 2.2.12 流式细胞术(FCM)测定细胞平均荧光强度38
• 2.2.13 共聚焦荧光图像的获取38
• 2.2.14 浓度的选择38
• 2.2.15 时间的选择38-39
• 2.2.16 温度的选择39
• 2.2.17 特异性结合39
• 2.2.18 探针灵敏度考察39
• 2.3 结果与讨论39-60
• 2.3.1 适体-DNA四面体荧光探针的建立39-40
• 2.3.2 适体-DNA四面体探针的合成和表征40-41
• 2.3.3 适体-DNA四面体探针细胞毒性的考察41-42
• 2.3.4 适体-DNA四面体探针稳定性考察42-43
• 2.3.5 适体-DNA四面体检测MCF-7细胞典型现象考察43-44
• 2.3.6 浓度的选择44-50
• 2.3.7 反应时间的选择50-57
• 2.3.8 温度的选择57
• 2.3.9 猝灭链比例的优化57-58
• 2.3.10 特异性结合58-59
• 2.3.11 探针灵敏度考察59-60
• 2.4 结论60-62
• 第三章 细胞核靶向的适体-DNA四面体载药系统用于逆转MDR62-82
• 3.1 引言62-64
• 3.2 实验部分64-69
• 3.2.1 试剂64-65
• 3.2.2 仪器65
• 3.2.3 DNA的分装65-66
• 3.2.4 高温高压灭菌66
• 3.2.5 细胞复苏与冻存66
• 3.2.6 细胞培养与传代66
• 3.2.7 玻片的处理66
• 3.2.8 AS 14111-A-Tetra的合成66
• 3.2.9 AS 14111-A-Tetra的凝胶电泳表征66
• 3.2.10 AS 1411-A-Tetra稳定性考察66-67
• 3.2.11 AS 1411-A-Tetra中阿霉素的载入67
• 3.2.12 AS1411-A-Tetra载药系统的细胞毒性考察67-68
• 3.2.13 细胞内阿霉素的蓄积量考察68
• 3.2.14 AS 1411-A-Tetra与Dox在细胞内分布考察68-69
• 3.3 结果与讨论69-81
• 3.3.1 AS 1411-A-Tetra载药系统的建立及药物运输原理69
• 3.3.2. AS 1411-A-Tetra载药系统的合成与表征69-70
• 3.3.3 AS 1411-A-Tetra稳定性考察70-72
• 3.3.4 阿霉素的载入72-74
• 3.3.5 AS1411-A-Tetra细胞毒性考察74-77
• 3.3.6 细胞内阿霉素蓄积量考察77-80
• 3.3.7 AS 1411-A-Tetra与Dox在细胞内分布考察80-81
• 3.4 结论81-82
• 参考文献82-91
• 致谢91-92
• 硕士期间发表论文92-93
• 附件93

【参考文献】

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1 ;Overcoming drug efflux-based multidrug resistance in cancer with nanotechnology[J];癌症;2012年02期

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本文编号：659443