MiR-143靶向PD-L1在电离辐射诱导胸腺瘤中的作用及机制研究

发布时间：2017-08-13 07:37

  本文关键词：MiR-143靶向PD-L1在电离辐射诱导胸腺瘤中的作用及机制研究

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【摘要】：随着核能在军事武器装各领域、工业领域、医疗领域以及科学研究等领域的应用不断普及和扩大,核能就像一把双刃剑,一方面能够极大造福我们人类,而另一方面则给我们带来了日益严重的电离辐射危害。而作为电离辐射最重要的远后效应之一,辐射致癌的发生率随着民众接触到电离辐射的机会越来越多而不断增加,已经受到了辐射相关从业人员以及普通民众的广泛关注。除了辐射致癌能直接对人员健康造成巨大的伤害,还由于辐射致癌的潜伏期长以及电离辐射看不见摸不着的特点会对民众造成巨大的心理恐慌,因此辐射致癌已经引起研究人员广泛的关注并开展了多方面的研究。MicroRNA(缩写为miRNA)又称小分子RNA或者微小RNA,是真核生物内的一类内源性的单链RNA,一般由21-25个核苷酸构成。首先由DNA转录形成长度300-1000个碱基的pri-miRNA(primary transcript),经过一次加工后成为长度70-90个碱基的miRNA前体pre-miRNA,再经过Dicer酶切成为长度21-25个碱基的成熟miRNA。作为非编码RNA,miRNA不是像别的mRNA那样通过中心法则中的翻译过程合成蛋白质来发挥其生物学功能,而是与靶基因转录成的mRNA 3'端非编码区通过碱基互补配对来相互结合,从而抑制靶基因翻译成蛋白起到沉默靶基因表达的作用。自1993年最先在线虫中发现了miRNA,随后在病毒、植物以及动物等上面发现了数以千计的miRNA,而每个miRNA又可以作用于几十甚至上百个靶基因,因此,miRNA虽小,但它调控的范围非常广,在正常的基因表达过程中发挥了极其重要的调节作用。MiRNA的高度保守性决定了miRNA在调控生物体最基本最重要的生物学过程中发挥重要作用。研究证实miRNA在细胞增殖、凋亡、分化、发育、免疫、肿瘤发生等一系列极为重要的生物学过程中发挥了不可或缺的调节作用。最新研究发现,在多种癌症中许多miRNA分别出现了明显的高表达或者低表达,这其中约有一半得到注解的miRNA基因组定位于和肿瘤相关的脆性位点,这说明niRNA与肿瘤的发生发展有着密不可分的关系。根据miRNA对肿瘤的调控作用,按功能可将miRNA分为癌基因样miRNA (OncomiR),如miR-21,以及抑癌样基因(Anti-oncomiR),如let-7。其中癌基因样miRNA的高表达或者抑癌基因样miRNA的低表达都会促进肿瘤的发生发展,反过来,癌基因样miRNA的低表达或者抑癌基因样miRNA的高表达则会抑制肿瘤的发生发展。本教研室的课题组近年来一直从事辐射致癌方面的研究,已经通过多次分开低剂量照射诱导小鼠胸腺瘤成功建立了小鼠的辐射致癌模型,并对辐射致癌过程中与正常组织相比表达差异比较大的蛋白、基因和miRNA进行了初步的研究。筛选出了一些表达差异比较明显的miRNA进行辐射致癌相关的后续研究,miR-143就是其中之一。MiR-143最早于2002年由Lagos-Quintana等从小鼠身上首次发现,人的miR-143位于5号染色体上33号位点。miR-143表达高度保守,已知的miR-143的靶基因有Klf4、Elk1、ADD3等,miR-143主要与心脏发育和癌症相关,研究发现miR-143属于抑癌基因样miRNA,它在胰腺癌、白血病、淋巴癌、骨肉瘤、肺癌、膀胱癌等细胞系中均表达明显下调。目前对辐射致癌的分子机制研究还多停留在单个信号通路上,还不够系统,离彻底揭示辐射致癌分子机制还有很长的路要走。对于niRNA在辐射致癌中的作用以及如何利用miRNA用于肿瘤的防治方面的研究还有待进一步的扩展和深入。本课题组通过miRNA芯片结果结合生物信息学预测在辐射诱导胸腺瘤中miR-143作用的靶蛋白很可能是PD-L1。PD-L1 (Programmed cell death ligand 1)是程序性细胞死亡受体1(Programmed cell death 1, PD-1)的配体之一,亦称CD274 (Cluster of differentiation 274)或者B7-H1 (B7 homolog 1)。1999年中国科学家陈列平率先发现了PD-L1,随后Dong等首次采用cDNA表达序列标签克隆出人B7-H1分子,而Freeman等发现它能够直接结合PD-1,然后发挥抑制T细胞活化的功能,遂将它称为PD-L1。作为B7免疫球蛋白超家族的第三个成员,它是一个分子量在40kD左右由290个氨基酸构成的Ⅰ型跨膜糖蛋白,与B7-DC(PD-L2, PD-1的另一个配体)、B7-1、B7-2以及ICOS的氨基酸同源性分别为40%、21%、20%和23%。人类的PD-L1基因位于9号染色体,而小鼠的则位于19号染色体,但它们相同的结构是都由短而带电的胞浆区、疏水结构的跨膜区以及包含一个免疫球蛋白V和一个免疫球蛋白C结构域的胞外区三部分构成。PD-L1的mRNA主要以4.2kb的形式存在,但也同时还以1.8kb、3.7kb以及7.2kb的不同转录形式存在。PD-L1广泛表达于正常组织中的APC、T/B淋巴细胞、DC、巨噬细胞、多种间质细胞等淋巴组织相关细胞,它主要通过调节机体免疫细胞的活性来抑制机体的免疫反应性。PD-L1还在大多数的肿瘤组织中表达,而且是高表达,但在肿瘤旁边的正常组织中却是低表达,这提示我们它在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。基于PD-L1通过调节机体免疫反应性在肿瘤的发生发展中发挥重要作用,而miRNA与多种癌症相关,并且在肿瘤发生发展中发挥重要调节作用,本文将miRNA与免疫负性共刺激分子PD-L1相结合,从利用miRNA调控PD-L1的表达进而调节机体免疫的角度来阐明PD-L1在辐射致癌中的作用,并初步探索通过调控PD-L1来防治辐射致癌的作用及其作用机制。研究内容：1.MiR-143在辐射诱导胸腺瘤中的作用：①观察正常小鼠胸腺组织与辐射诱导小鼠胸腺瘤组织中miR-143的表达差异；②分别观察上调、下调miR-143对细胞增殖与凋亡的影响；③观察EL4细胞中上调miR-143表达对细胞裸鼠荷瘤成功率及肿瘤生长的影响。2.MiR-143在辐射诱导胸腺瘤中的作用机制：①预测miR-143以3'UTR依赖的方式靶向作用PD-L1影响辐射诱导胸腺瘤的发生发展；②通过Rescue实验进一步验证PD-L1确实是miR-143的靶蛋白。3.电离辐射对PD-L1表达的影响以及辐射诱导胸腺瘤中miR-143与PD-L1表达之间的关系：①观察同一剂量照后不同时间以及不同剂量照后同一时间小鼠胸腺组织PD-L1表达变化；②观察正常小鼠胸腺组织和辐射诱导胸腺瘤小鼠胸腺组织中PD-L1表达的差异；③观察辐射诱导胸腺瘤小鼠胸腺组织中miR-143与PD-L1表达之间的关系。实验方法：1.γ射线照射条件：采用实验用钴-60γ射线进行照射,剂量率为每分钟0.58Gy。2.细胞培养：小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞培养基为DMEM培养基加入10%胎牛血清以及每毫升培养基各加入100单位的青霉素和链霉素；小鼠淋巴瘤细胞EL4细胞培养条件为RMPI-1640培养基加入10%胎牛血清以及每毫升培养基各加入100单位的青霉素和链霉素,于细胞培养箱进行培养。3.实时荧光定量PCR测定：采用SYBRGreen Ⅰ法,利用罗氏实时荧光定量PCR仪通过产物溶解曲线来进行相对定量。4.细胞活力检测：MTT法检测细胞的光密度值来确定细胞的增殖与活性。5.细胞凋亡检测：采用Annexin Ⅴ/PI双染凋亡检测试剂盒通过流式细胞仪来检测细胞凋亡比率。6.蛋白表达检测：通过与特异性抗体结合利用流式细胞仪检测细胞平均荧光强度或者抗体标记阳性细胞比率来确定蛋白相对表达量。7.RNA转染：根据Iipo2000转染试剂盒操作提示将目的miRNA以及无意义miRNA转入细胞。8.腺病毒感染：将pre-miR-143前体通过腺病毒转染目的细胞以上调miR-143表达。9. MiRNA芯片：委托上海博奥生物集团有限公司完成。10.双荧光报告基因检测：利用双荧光报告基因检测试剂盒检测miR-143对PD-L1的3'UTR报告基因活性影响。11.裸鼠荷瘤：EL4细胞消化收集后配成107个/m1的浓度,将0.2m1细胞悬液注射到裸鼠颈背部皮下。12.统计方法：两组实验结果之间采用t检验,多组实验结果之间采用方差分析,p0.05表示有统计学差异。实验结果：1.MiR-143在辐射诱导胸腺瘤中发挥抑制作用1.1通过miRNA芯片检测发现辐射诱导胸腺瘤中miR-143的拷贝数远远低于正常胸腺组织；在对15对辐射诱导胸腺瘤与正常胸腺组织样本通过实时荧光定量PCR检测中,也同样发现辐射诱导小鼠胸腺瘤中miR-143的表达明显低于正常小鼠胸腺组织。1.2通过脂质体转染以及腺病毒转染上调miR-143表达可以显著抑制NIH3T3以及EL4细胞的增殖,而且miR-143表达上调的越厉害对EL4细胞增殖的抑制作用就越强烈。1.3无论是NIH3T3细胞还是EL4细胞,通过miR-143的反义抑制剂(miR-143ASO)下调miR-143后,通过MTT法检测结果发现下调miR-143的表达能够显著降低细胞的增殖活性。1.4在EL4细胞中,通过脂质体转染以及腺病毒转染上调miR-143表达可以增加细胞的凋亡,且细胞凋亡水平随着miR-143表达的上调程度越大而增加越多；通过miR-143 ASO下调NIH3T3细胞中miR-143表达可以显著抑制其凋亡。1.5将采用腺病毒转染上调miR-143表达的EL4细胞和普通EL4细胞注射到裸鼠背颈部皮下,通过观察30天内裸鼠背颈部肿瘤生成率,发现过表达miR-143的EL4细胞在荷瘤小鼠的成瘤率显著降低,并且肿瘤体积也明显要小。2.MiR-143以3'UTR依赖的方式靶向作用于PD-L1抑制辐射诱导胸腺瘤的发生发展2.1双荧光报告基因检测结果提示：在PD-L1的3'UTR野生型组,上调miR-143的表达可以显著抑制PD-L1的表达；而在PD-L1的3'UTR突变体组,miR-143表达的上调与PD-L1的表达变化关系不明显,没有统计学意义。而通过抗体标记后利用流式细胞仪检测平均荧光强度的结果发现,过表达miR-143可以显著降低PD-L1的表达水平。这说明miR-143以3'UTR依赖的方式靶向作用PD-L1。2.2上调miR-143和PD-L1表达的EL4细胞能够逆转仅上调miR-143表达的EL4细胞中由于miR-143上调导致的细胞凋亡,同时还能够提高细胞的增殖与活性,Rescue实验结果从另一方面证实了在电离辐射诱导胸腺瘤中PD-L1确实是miR-143的作用靶蛋白。3.电离辐射能够诱导正常胸腺组织中PD-L1高表达且在辐射诱导胸腺瘤中miR-143与PD-L1表达负相关3.1 BALB/c小鼠8Gy照后0h、12h、24h、48h以及空白对照组胸腺组织研磨成单细胞悬液,抗体标记后流式细胞仪检测PD-L1表达变化,照后0-24h,PD-L1表达迅速增加,PD-L1表达增加与时间延长近似成线性正相关,24h之后,PD-L1表达不再升高达到一个平台期；BALB/c小鼠OGy、2Gy、4Gy、6Gy和8Gy组照后24h,PD-L1表达升高先快后慢,整体近似成线性增加。这说明辐射能够诱导正常小鼠胸腺组织PD-L1表达上调且具有一定的照后时间和照射剂量依赖性。3.2辐射诱导胸腺瘤与正常胸腺组织研磨成单细胞悬液,抗体标记后通过流式细胞仪检测平均荧光强度来确定PD-L1表达,辐射诱导小鼠胸腺瘤的PD-L1表达比正常小鼠胸腺组织的明显要高。3.3辐射诱导胸腺瘤中PD-L1蛋白表达显著升高而PD-L1的mRNA变化不明显,miR-143与PD-L1蛋白的表达水平负相关。并且PD-L1蛋白表达与PD-L1的mRNA表达的比值与miR-143的表达也成负相关关系。实验讨论：随着人类对核能的利用越来越广泛,民众受到辐射致癌的危险也越来越高,但是迄今为止,对辐射致癌机理的研究还没有一个明确的解释,对辐射致癌的防治也尚无比较好的治疗的途径。近年来随着肿瘤免疫治疗研究的兴起,负性共刺激因子PD-L1因为通过调节机体的免疫平衡影响肿瘤的发生发展成为研究热点,而大量miRNA基因组定位于和肿瘤相关的脆性位点,这说明miRNA与肿瘤的发生发展关系极为密切。正是基于此,本课题期望从miR-143通过调节PD-L1进而调节机体免疫从而在辐射致癌中发挥作用来初步探讨PD-L1在电离辐射诱导胸腺瘤中的作用及相关潜在的辐射致癌防治的可能途径。本课题研究发现miR-143在辐射诱导胸腺瘤中低表达,它对细胞能够抑增殖和促凋亡,并且miR-143以3'UTR依赖的方式靶向作用于PD-L1。在辐射诱导胸腺瘤中它还与PD-L1蛋白表达负相关,并且通过上调miR-143表达抑制PD-L1的表达,进而能够降低细胞增殖与活性、提高细胞凋亡率,发挥辐射致癌的防治作用。另一方面辐射能够诱导机体PD-L1表达升高,在辐射诱导胸腺瘤等一系列肿瘤中PD-L1也是高表达,而PD-L1在肿瘤的免疫逃逸机制做发挥重要作用,这也提示我们通过抑制PD-L1的表达可能能够起到防治辐射致癌的作用。总而言之,通过电离辐射诱导细胞下调miR-143来上调PD-L1表达可能是促进电离辐射诱导胸腺瘤发生发展的一个作用途径,而通过反向干预这一调节过程就有可能起到防治辐射致癌的作用。
【关键词】：PD-L1 miR-143 辐射致癌 肿瘤防治 辐射诱导胸腺瘤
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R736.3;R594.8
【目录】：

• 摘要5-11
• Abstract11-18
• 缩略词18-19
• 前言19-21
• 第一部分：MiR-143在辐射诱导胸腺瘤中的作用21-30
• 一、实验材料21-22
• 二、实验方法22-23
• 三、实验结果23-29
• 四、讨论29-30
• 第二部分：MiR-143在辐射诱导胸腺瘤中的作用机制30-36
• 一、实验材料30-31
• 二、实验方法31-32
• 三、实验结果32-35
• 四、讨论35-36
• 第三部分：辐射诱导胸腺瘤中PD-L1表达及与miR-143表达的关系36-44
• 一、实验材料36-37
• 二、实验方法37
• 三、实验结果37-43
• 四、讨论43-44
• 全文总结44-47
• 参考文献47-53
• 综述53-63
• 参考文献57-63
• 文章发表63-64
• 致谢64

【共引文献】

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本文编号：666170