转录因子FOXM1不同剪接异构体在乳腺癌EMT过程中的功能研究

发布时间：2017-08-13 15:20

  本文关键词：转录因子FOXM1不同剪接异构体在乳腺癌EMT过程中的功能研究

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【摘要】：乳腺癌作为威胁女性健康最为常见的恶性肿瘤之一,其发病率在中国上升趋势明显。乳腺癌细胞的生长特性是:能无限生长、具有转化和转移能力。因此对乳腺癌进行增殖、转移等作用机制进行深入研究,为肿瘤治疗方案及临床耐药提供新的靶点。选择性剪接是指将同一种前体m RNA剪接成多种不同的成熟m RNA剪接变异体,进而产生结构和功能不同的蛋白质的过程。m RNA的选择性剪接是真核生物产生蛋白质多样性与基因表达复杂性的主要原因。研究发现,在多种动物组织中,至少90%蛋白编码基因存在选择性剪接现象。选择性剪接导致了蛋白质的多样性,与多细胞动物细胞增殖、分化和死亡密切相关。研究选择性剪接的发生机制、调控以及相应蛋白异构体的功能对于肿瘤的诊断和治疗具有重要的意义。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)是指上皮类型细胞丢失上皮特性如细胞与细胞之间的相互作用等现象,同时获得了间质表型如细胞移动能力增强。EMT在胚胎的正常发育和组织器官的分化过程中扮演着重要的角色。EMT对胚胎的着床、原肠胚的形成、伤口愈合、组织再生和器官纤维化等生理和病理过程有重要作用,近年来研究认为EMT是导致恶性肿瘤发生转移尤其是肿瘤细胞发生侵袭行为的重要分子机制。转录因子FOXM1是叉头框(Forkhead box)家族成员,被发现在多种类型肿瘤中都存在高表达,如乳腺癌、肺癌等。研究证实FOXM1在肿瘤的发生和发展过程中起到了至关重要的作用,因而它也被认为是预防肿瘤发生和肿瘤治疗的潜在靶基因。目的:探究转录因子FOXM1不同的剪接异构体对乳腺癌EMT过程中的影响。方法:采用基因工程方法分别构建了表达FOXM1B-EGFP和FOXM1C-EGFP两种FOXM1剪接异构体真核表达质粒,并将其转染进乳腺癌细胞,采用RT-PCR和Western印迹检测细胞样本中FOXM1剪接异构体的表达和EMT相关基因表达,同时采用transwell检测高表达不同FOXM1剪接异构体细胞的侵袭和迁移能力。结果:成功构建了FOXM1B-EGFP和FOXM1C-EGFP真核表达质粒。外源FOXM1B在乳腺癌间质型细胞的表达高于上皮型细胞,并主要存在于细胞核内,且高表达FOXM1B能够显著促进乳腺癌细胞的侵袭和EMT过程。外源FOXM1C在乳腺癌上皮型细胞中的表达高于间质型细胞,并且在细胞核和细胞质中均有表达,高表达FOXM1C能够显著抑制细胞的侵袭和EMT过程。结论:乳腺癌细胞中,FOXM1B主要存在于细胞核内,FOXM1C在细胞核和细胞质中均有表达。本研究预示FOXM1B和FOXM1C对乳腺癌细胞EMT过程发挥不同的影响。
【关键词】：乳腺癌细胞 FOXM1B FOXM1C 迁移 EMT
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第1章 绪论14-25
• 1.1 乳腺癌概述14-15
• 1.2 上皮间质转化——EMT过程15-19
• 1.2.1 上皮间质转化概述15-16
• 1.2.2 上皮间质转化相关功能16-17
• 1.2.3 上皮间质转化相关调节机制17-19
• 1.2.4 上皮间质转化与表观遗传学19
• 1.3 真核生物mRNA的选择性剪切与连接19-21
• 1.3.1 选择性剪接的机制和模式19-20
• 1.3.2 选择性剪接内部外显子的选择调控20
• 1.3.3 选择性剪接与肿瘤20-21
• 1.4 转录因子21-23
• 1.4.1 转录因子概述21
• 1.4.2 转录因子FOXM1概述21-22
• 1.4.3 转录因子FOXM1的生物学功能22-23
• 1.4.4 转录因子FOXM1与肿瘤23
• 1.5 本论文的工作设想23-25
• 第2章 内源性FOXM1B/C表达与乳腺癌细胞迁移能力25-39
• 2.1 前言25
• 2.2 实验材料和仪器25-28
• 2.2.1 细胞25
• 2.2.2 其他材料和试剂25-27
• 2.2.3 主要实验仪器27-28
• 2.3 实验方法28-36
• 2.3.1 细胞株培养、冻存和复苏28-29
• 2.3.2 细胞计数29
• 2.3.3 Transwell实验29-30
• 2.3.4 总RNA提取、逆转录以及RT-PCR30-33
• 2.3.5 Western Blotting（WB）33-36
• 2.3.6 统计分析36
• 2.4 结果与讨论36-39
• 2.4.1 研究体系的确定36-38
• 2.4.2 讨论38-39
• 第3章 FOXM1B/C-EGFP真核表达质粒的构建与胞内表达39-51
• 3.1 前言39-40
• 3.2 实验材料和仪器40-42
• 3.2.1 细胞和质粒模板40
• 3.2.2 其他材料和试剂40-41
• 3.2.3 主要实验仪器41-42
• 3.3 实验方法42-46
• 3.3.1 FOXM1融合蛋白表达质粒的构建42-45
• 3.3.2 质粒转染45-46
• 3.3.3 Western Blotting46
• 3.3.4 荧光观测46
• 3.3.5 统计分析46
• 3.4 结果与讨论46-51
• 3.4.1 质粒构建46-47
• 3.4.2 重组质粒在真核细胞MCF-7 和MDA-MB-231细胞内的表达47
• 3.4.3 FOXM1B/C在细胞内的定位47-49
• 3.4.4 讨论49-51
• 第4章 高表达FOXM1B促进上皮间质转化过程51-56
• 4.1 前言51
• 4.2 实验材料和仪器51-53
• 4.2.1 细胞51
• 4.2.2 其他材料和试剂51-52
• 4.2.3 主要实验仪器52-53
• 4.3 实验方法53-54
• 4.3.1 细胞株培养53
• 4.3.2 质粒转染53
• 4.3.3 总RNA提取、逆转录以及RT-PCR53
• 4.3.4 Western Blotting（WB）53
• 4.3.5 Transwell实验53
• 4.3.6 统计分析53-54
• 4.4 结果与讨论54-56
• 4.4.1 MCF-7细胞中高表达FOXM1B各基因的表达情况54
• 4.4.2 MCF-7细胞中高表达FOXM1B迁移能力的变化54-55
• 4.4.3 讨论55-56
• 第5章 高表达FOXM1C抑制上皮间质转化过程56-61
• 5.1 前言56
• 5.2 实验材料和仪器56-58
• 5.2.1 细胞56
• 5.2.2 其他材料和试剂56-57
• 5.2.3 主要实验仪器57-58
• 5.3 实验方法58-59
• 5.3.1 细胞株培养58
• 5.3.2 质粒转染58
• 5.3.3 总RNA提取、逆转录以及RT-PCR58
• 5.3.4 Western Blotting（WB）58
• 5.3.5 Transwell实验58
• 5.3.6 统计分析58-59
• 5.4 结果与讨论59-61
• 5.4.1 MDA-MB-231细胞中高表达FOXM1C各基因的表达情况59
• 5.4.2 MDA-MB细胞中高表达FOXM1C迁移能力的变化59-60
• 5.4.3 讨论60-61
• 总结与展望61-63
• 1 结论61
• 2 展望61-63
• 参考文献63-69
• 附录A 英文缩写69-70
• 附录B 常用缓冲液和试剂配方70-72
• 附录C 攻读学位期间发表的论文72-73
• 致谢73

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