抗肿瘤溶栓嵌合蛋白制备与生物活性研究

发布时间：2017-08-14 12:08

  本文关键词：抗肿瘤溶栓嵌合蛋白制备与生物活性研究

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【摘要】：肿瘤患者的常见并发症之一是血栓。肿瘤发生与血栓形成的关系比较密切,血栓在肿瘤血管生成、肿瘤转移等机制中起着重要作用,肿瘤并发血栓被称为Trousseau综合症。恶性肿瘤患者中血栓发生率约为10%-30%,临床研究表明,血栓是目前癌症患者第二死亡原因,血栓可谓肿瘤患者的隐形杀手。因此,肿瘤并发血栓是一个不容忽视的问题。金葡球菌肠毒素C2(staphylococcal enterotoxins, SEC2)是由金葡球菌分泌的一种细菌性超抗原,临床上对肺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌等恶性肿瘤均表现出良好的治疗效果。葡激酶(staphylokinase, Sak)是金葡球菌分泌的另一种重要蛋白,具有溶栓活力强、溶栓作用专一、过敏反应少及可以有效避免出血反应等优点。实验室已将天然SEC2的N端和C端进行改造,分别剔除了N端17个氨基酸和C端的132个氨基酸,分析得出该突变体△SEC2的超抗原活性得已保留,且降低了天然SEC2的免疫原性；类似的,实验室还构建出缺失了N端10个氨基酸但溶栓活性不变的葡激酶突变体蛋白,并将它与突变体△SEC2基因进行嵌合,分别得到了嵌合蛋白△Sak-△SEC2和△SEC2-ASak。以实验室前期研究为基础,对抗肿瘤溶栓嵌合蛋白制备工艺进行优化,对重组大肠杆菌的培养条件和诱导条件进行优化,并对其超抗原活性进行深入研究,利用嵌合蛋白结合组织相容性复合体ⅡⅡ分子(major histocompatibility complex, MHCⅡ)能力研究、体外促淋巴细胞增值实验、体外抑瘤实验、小鼠体内肿瘤抑制实验来进一步研究抗肿瘤溶栓嵌合蛋白的活性。研究结果如下：1)嵌合蛋白制备条件优化以装液量、接菌量和初始pH值三因素设计正交试验,确定其最佳培养条件；以诱导时间、诱导温度和诱导剂浓度三因素设计正交试验,确定其最佳诱导条件。结果表明：抗肿瘤溶栓嵌合蛋白制备工艺的最佳培养条件是装液量100m1、接种量2%、初始pH值7.5,最佳诱导条件是诱导时间4h、诱导温度33℃、诱导剂浓度0.6mM。2)嵌合蛋白结合MHCⅡ分子能力研究制备得到的嵌合蛋白与癌细胞表面的MHCⅡ分子作用,在不同蛋白浓度和不同时间的条件下比较得出嵌合蛋白可能与MHCⅡ分子的结合能力随着蛋白浓度的增大而增强,且与SEC2无明显差异,但结合能力与时间没有关系。3)体外生物学活性分析得到纯化蛋白后进行活性的分析与检测。根据研究的目的主要分析嵌合蛋白以下几个生物学活性：蛋白体外抑制肿瘤细胞生长活性、促进PBMC细胞增殖活性。实验结果表明,嵌合蛋白保留了SEC2的体外促淋巴细胞增殖活力和抑制胃癌、结肠癌、白血病的活性。抑制肿瘤的活性和促进淋巴细胞增殖的活性都是随着蛋白浓度的增大而增强,且与SEC2无明显差异。4)体内抗肿瘤活性分析采用小鼠移植瘤模型,对抗肿瘤溶栓嵌合蛋白抗肿瘤的作用进行研究,以进一步揭示抗肿瘤溶栓嵌合蛋白在肿瘤治疗方面的意义。构建小鼠S180肉瘤移植瘤模型,分别腹腔注射高、中、低剂量(100、50、10μg/ml)的抗肿瘤溶栓嵌合蛋白,连续给药8d,同时以SEC2为阳性对照,PBS为阴性对照。于给药后第9天处死小鼠,将肿瘤组织分离并称重。结果表明,抗肿瘤溶栓嵌合蛋白能够显著降低8180荷瘤小鼠平均瘤重,与阴性对照组比较具有显著性差异,抗肿瘤溶栓嵌合蛋白能明显延长S180荷瘤小鼠的生存时间,显著提高荷瘤小鼠的脾指数和肝指数。综上所述,本研究能够提高抗肿瘤溶栓嵌合蛋白的表达量,证明了抗肿瘤溶栓嵌合蛋白无论在体外还是体内都具有较好的超抗原活性。该研究将对于治疗肿瘤并发血栓具有重要意义,将可能成为新型治疗药物并为其进一步的研究和开发奠定良好的基础。
【关键词】：Trousseau综合症 嵌合蛋白 制备 生物活性
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 前言13-18
• 0.1 恶性肿瘤并发血栓13-14
• 0.1.1 恶性肿瘤并发血栓形成的机制13-14
• 0.1.2 肿瘤并发血栓形成的治疗14
• 0.2 金黄色葡萄球菌肠毒素C2超抗原14-16
• 0.2.1 金黄色葡萄球菌14-15
• 0.2.2 金黄色葡萄球菌肠毒素C215
• 0.2.3 SEC2的抗肿瘤机制15-16
• 0.2.4 SEC2缺失突变体16
• 0.3 金黄色葡萄球菌激酶16-17
• 0.3.1 Sak的溶栓作用机制16-17
• 0.3.2 Sak缺失突变体17
• 0.4 实验室前期研究17
• 0.5 研究目的和意义17-18
• 第1章 嵌合蛋白制备条件优化18-26
• 1.1 实验目的18
• 1.2 方案设计与分析18
• 1.3 实验材料与试剂18-21
• 1.3.1 实验菌种18-19
• 1.3.2 实验试剂19-20
• 1.3.3 仪器与设备20
• 1.3.4 常用培养基配置20-21
• 1.4 实验方法21-22
• 1.4.1 菌株的活化21
• 1.4.2 重组大肠杆菌培养条件优化21
• 1.4.3 抗肿瘤溶栓嵌合蛋白诱导条件优化21-22
• 1.5 结果与讨论22-25
• 1.5.1 培养条件优化结果22-24
• 1.5.2 诱导条件优化结果24-25
• 1.6 分析与讨论25-26
• 第2章 嵌合蛋白结合MHC Ⅱ类分子能力研究26-34
• 2.1 实验目的26
• 2.2 方案设计与分析26
• 2.3 实验材料和试剂26-29
• 2.3.1 实验菌株和细胞26
• 2.3.2 实验试剂26-27
• 2.3.3 实验仪器与设备27
• 2.3.4 实验试剂配制27-29
• 2.4 实验方法29-32
• 2.4.1 抗肿瘤溶栓嵌合蛋白制备29-30
• 2.4.2 蛋白样品测定30
• 2.4.3 Western blot方法检测嵌合蛋白结合MHC Ⅱ类分子能力30-32
• 2.5 结果32-33
• 2.6 分析与讨论33-34
• 第3章 嵌合蛋白体外活性研究34-43
• 3.1 实验目的34
• 3.2 方案设计与分析34
• 3.3 实验材料和试剂34-36
• 3.3.1 细胞系34-35
• 3.3.2 实验试剂35
• 3.3.3 仪器与设备35
• 3.3.4 细胞培养溶液的配置35-36
• 3.4 实验方法36-40
• 3.4.1 细胞的复苏36-37
• 3.4.2 823、HT-29细胞的传代和培养37
• 3.4.3 k562细胞的传代和培养37
• 3.4.4 细胞计数方法37-38
• 3.4.5 鼠脾淋巴细胞增殖试验38-39
• 3.4.6 体外抑瘤试验39-40
• 3.5 结果40-41
• 3.5.1 嵌合蛋白刺激鼠PBMC细胞增殖活性40
• 3.5.2 融合蛋白体外对肿瘤的抑制作用40-41
• 3.6 分析与讨论41-43
• 第4章 嵌合蛋白体内活性研究43-49
• 4.1 实验目的43
• 4.2 方案设计与分析43
• 4.3 实验材料与试剂43-44
• 4.3.1 实验材料43
• 4.3.2 实验试剂43-44
• 4.3.3 仪器与设备44
• 4.4 实验方法44-45
• 4.4.1 S_(180)肉瘤小鼠移植瘤模型的构建44
• 4.4.2 动物分组及给药44
• 4.4.3 肿瘤、肝脏、脾脏组织的分离和小鼠眼眶取血44-45
• 4.5 结果45-48
• 4.6 分析与讨论48-49
• 第5章 结论与展望49-51
• 致谢51-52
• 参考文献52-57
• 攻读学位期间发表论文以及参加科研情况57

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