Ad-pre-microRNA-193b重组腺病毒的构建及其抗白血病效应探讨

发布时间：2017-08-20 20:13

  本文关键词：Ad-pre-microRNA-193b重组腺病毒的构建及其抗白血病效应探讨

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【摘要】：目的构建microRNA-193b (miR-193b)前体Ad-pre-miR-193b重组腺病毒载体,并鉴定其在慢性粒细胞白血病细胞株K562中的表达水平,进一步探讨高效表达miR-193b对K562细胞的抑制效应及其作用机制,为后续研究miR-193b在CML动物模型中的抗白血病效应提供实验依据。方法1.化学合成miR-193b cDNA序列,克隆进入pAdTrack-CMV穿梭质粒,经Pme I酶切线性化后转入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态中进行同源重组,获得pAd-miR-193b重组腺病毒质粒,再经PacI线性化后转入HEK293细胞中包装、扩增。收集病毒后感染K562细胞(设为Ad-pre-miR-193b组),同时设空白组(K562细胞组)及空载病毒组(Ad组),采用QRT-PCR检测K562细胞中miR-193b基因的表达水平。2.经鉴定的Ad-pre-miR-193b重组腺病毒感染K562细胞,同时设空白组(K562细胞组)及空载病毒组(Ad组),采用QRT-PCR检测miR-193b基因的表达水平；QRT-PCR和Western Blot分别检测bcr/abl融合基因、BCR/ABL融合蛋白的表达水平；CCK-8法检测K562细胞的增殖情况,流式细胞术(FCM)检测K562细胞凋亡率。3.经鉴定的Ad-pre-miR-193b重组腺病毒感染K562细胞后,采用Western Blot检测凋亡蛋白caspase-3的表达水平。结果1. pAdTrack-CMV-pre-miR-193b重组穿梭质粒和pAd-pre-miR-193b重组腺病毒质粒经限制性内切酶鉴定及测序分析显示构建成功；重组腺病毒质粒在HEK293细胞中包装成功,并能够高效转染K562细胞；与对照组相比,QRT-PCR检测显示重组腺病毒载体感染K562细胞后其miR-193b基因表达水平明显增加(P0.01)。2.与对照相比,K562细胞在感染Ad-pre-miR-193b重组腺病毒后,其miR-193b表达水平显著升高；bcr/abl融合基因及BCR/ABL蛋白表达水平明显下调(P0.05)；K562细胞增殖能力降低(P0.05)；K562细胞凋亡水平明显上升(P＜0.05), caspase-3表达水平增高(P0.01)。结论1.成功构建Ad-pre-miR-193b重组腺病毒,并能高效感染K562细胞,实现miR-193b基因在细胞内的高效表达。2.高效表达的]miR-193b可下调慢粒白血病bcr/abl融合基因和BCR/ABL融合蛋白的表达水平,抑制K562细胞的生物学效应,提示高效表达miR-193b可成为治疗CML的有效靶点,其作用机制可能通过上调凋亡蛋白caspase-3的表达,从而抑制K562细胞增殖,促进其凋亡。
【关键词】：miR-193b K562细胞 bcr/abl caspase-3
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.7
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 第一部分 Ad-pre-miR-193b重组腺病毒的构建及其表达鉴定15-32
• 1 材料与方法15-26
• 2 结果与分析26-30
• 3 讨论30-32
• 第二部分 Ad-pre-miR-193b重组腺病毒的抗白血病效应检测及其机制探讨32-44
• 1 材料与方法32-38
• 2 结果与分析38-42
• 3 讨论42-44
• 参考文献44-47
• 全文总结47-48
• 文献综述48-56
• 参考文献53-56
• 致谢56-57
• 攻读硕士研究生期间发表的文章57

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本文编号：708625