amorfrutin A对NF-κB和STAT3双重信号通路作用机制研究

发布时间：2017-08-20 21:00

  本文关键词：amorfrutin A对NF-κB和STAT3双重信号通路作用机制研究

  更多相关文章： NF-κB STAT3 炎症 肿瘤 amorfrutin A

【摘要】：NF-κB和STAT3是联系炎症和癌症的两个主要转录因子,调控许多生理病理过程,如炎症、免疫、肿瘤发生发展、增殖、凋亡、周期、侵袭和血管生成。在静息的细胞中的NF-κB和STAT3主要存在于细胞质中,当受到适当的外界刺激如TNF-α、IL.6、LPS和EGF等,NF-κB和STAT3就会被激活,活化后的NF-κB和STAT3进入细胞核与DNA结合介导下游基因的表达。NF-κB和STAT3调控的靶基因具有高度的重叠性。amorfrutinA是从豆科灌木紫穗槐的果实中提取出的天然小分子化合物,已报道结合核受体PPARγ能改善胰岛素的耐药性、及其他的代谢和炎症参数,而不会引起脂肪积累和其他副作用如肝毒性。虽然amorfrutin A有良好的抗糖尿病作用,然而对于NF-κB和STAT3介导的抗炎抗肿瘤作用机制尚不明确。本文就amorfrutin A在NF-κB和STAT3作用机制及其靶基因方面进行了研究.结果发现：amorfrutin A抑制NF-κB的活化是通过抑制TNF-α诱导的IκBα的磷酸化及降解,从而抑制p65的核易位及NF-κB结合DNA的活性等途径实现的。同时也发现amorfrutin A是STAT3的一个抑制剂,amorfrutin A抑制TNF-a诱导的p-STAT3(Tyr705和Ser727)和STAT3的核易位及STAT3的分子伴侣HSP90α/β。进一步的研究发现amorfrutin A抑制STAT3的活化与其抑制JAK2/STAT3和ERK这两个信号通路相关。接着我们又检测了amorfrutin A对 NF-κB和STAT3下游靶基因的影响,结果表明amorfrutin A剂量型的下调TNF-α诱导的抗凋亡蛋白(Bcl2.Bcl-xL.c-IAP1、c-IAP2、survivin、XIAP.FLIP)、增殖相关蛋白(COX-2)、入侵和迁移相关蛋白(MMP-9.ICAM-1、vimentin)、血管生成蛋白(VEGF)的表达；并抑制主要的炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和MCP-1的mRNA表达。细胞集落形成实验和MTT都进一步证明了amorfrutin A能够抑制增殖。而且amorfrutin A能够促进TNF-α诱导的凋亡,并提高TNF-α诱导的caspase-3和PARP的蛋白水解过程。此外amorfrutin A剂量型地逆转TNF-a诱导的G1/S期转变,导致细胞停滞在G1期。同时抑制TNF-α诱导细胞周期进程正调控蛋白cyclin D1,c-Myc,Skp2的表达,并且上调细胞周期进程负调控蛋白p53,p21,p27的表达；PCR实验结果进一步表明amorfrutin A在转录水平上抑制cyclinD1, c-Myc的表达。总之我们的研究结果表明amorfrutin A有望用于治疗NF-κB和STAT3异常活化引起的炎性疾病和癌症。
【关键词】：NF-κB STAT3 炎症 肿瘤 amorfrutin A
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略词简表10-15
• 第一章 前言15-22
• 1.1 炎症和肿瘤15
• 1.2 NF-κB15-18
• 1.2.1 NF-κB的简介15-16
• 1.2.2 NF-κB的活化16-17
• 1.2.3 NF-κB与炎症17
• 1.2.4 NF-κB与肿瘤17-18
• 1.3 STAT318-20
• 1.3.1 STAT3的简介18
• 1.3.2 STAT3的活化18-19
• 1.3.3 STAT3与炎症19
• 1.3.4 STAT3与肿瘤19-20
• 1.4 NF-κB与STAT320-21
• 1.5 amorfrutin A21-22
• 第二章 材料与方法22-38
• 2.1 材料22-27
• 2.1.1 细胞系及来源22
• 2.1.2 药物22
• 2.1.3 试剂及抗体22-25
• 2.1.4 仪器25-27
• 2.2 实验方法27-38
• 2.2.1 细胞培养27
• 2.2.2 amorfrutin A浓度配置27
• 2.2.3 通过Luciferase reporter assay检测amofrutin A对NF-κB和STAT的转录活性的影响27-28
• 2.2.4 MTT法检测细胞毒性28
• 2.2.5 细胞集落形成实验28
• 2.2.6 Western blot法28-32
• 2.2.7 免疫荧光法检测p65和STAT3的核易位32
• 2.2.8 EMSA法32-34
• 2.2.9 RNA提取及PCR34-37
• 2.2.10 细胞凋亡37
• 2.2.11 细胞周期37-38
• 第三章 结果38-57
• 3.1 amorfutin A对NF-κB信号通路的影响38-42
• 3.1.1 Luciferase reporter assay检测结果38
• 3.1.2 MTT实验结果38-39
• 3.1.3 Western blot检测结果39-40
• 3.1.4 免疫荧光实验检测结果40
• 3.1.5 EMSA检测结果40-41
• 3.1.6 讨论41-42
• 3.1.7 结论42
• 3.2 amorfrutin A作用于STAT3信号通路研究42-47
• 3.2.1 Luciferase reporter assay检测结果42
• 3.2.2 Western blot法检测pSTAT3和STAT342-43
• 3.2.3 免疫荧光实验检测结果43
• 3.2.4 Western blot实验检测STAT3分子伴侣HSP9043-44
• 3.2.5 Western blot实验检测STAT3的上游信号通路44-46
• 3.2.6 讨论46-47
• 3.2.7 结论47
• 3.3 amorfrutin A对NF-κB和STAT3下游基因的影响47-57
• 3.3.1 Western blot法检测抗凋亡、增殖、迁移、血管生成等蛋白质的表达47-48
• 3.3.2 PCR法检测炎性细胞因子和趋化因子48-49
• 3.3.3 细胞增殖实验49-50
• 3.3.4 细胞凋亡实验50-52
• 3.3.5 细胞周期实验52-54
• 3.3.6 讨论54-55
• 3.3.7 结论55-57
• 第四章 结论57-58
• 参考文献58-64
• 致谢64

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