小鼠肝脏磷酸化蛋白质组学方法构建与HBx通过调控PDK1磷酸化参与HCC发生

发布时间：2017-08-21 00:05

  本文关键词：小鼠肝脏磷酸化蛋白质组学方法构建与HBx通过调控PDK1磷酸化参与HCC发生

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【摘要】：磷酸化修饰是一种重要的翻译后修饰方式,调节着细胞信号转导、细胞凋亡、肌肉收缩、新陈代谢等生物学过程,但由于蛋白质磷酸化在细胞内的低化学计量、不均一性以及实验技术的限制,许多磷酸化现象还未得以发现。近年由于质谱技术的快速发展,结合磷酸化肽段富集技术使得对磷酸化进行大规模鉴定成为可能,结合生物信息分析,可以获得全面的磷酸化蛋白质组的信息,为细胞基本生命活动分子机制、疾病发生机制及和药物靶点等多方面研究提供一个有力的平台。磷酸化蛋白质组学是一种高通量蛋白分离和质谱技术结合的磷酸化蛋白鉴定的学科,通过对于磷酸化蛋白质组学数据的分析,来发现疾病相关的分子标志物、诊断标志物和治疗靶点,蛋白质磷酸化位点、数目及其动态变化的鉴定具有十分重要的意义。磷酸化修饰起到广泛的调节作用,很多疾病的发生都是由磷酸化修饰的异常而导致的,蛋白质的磷酸化调控网络是由蛋白激酶、磷酸结合蛋白、磷酸酶三个部分组成。蛋白激酶是其中重要的调节因子,很多疾病的发生与磷酸化修饰的失调和磷酸化调控网络的紊乱有关[2],蛋白激酶中每一个磷酸化位点的修饰都具有重要的生物学意义,磷酸化修饰通过改变蛋白的构象改变和蛋白与蛋白之间的相互作用而起到功能调节的作用。HBV是双链环状DNA病毒,由编码外壳蛋白的S区、编码核心蛋白的C区、编码聚合酶的P区以及X区四部分组成。HBx是HBV开放阅读块X区编码的的蛋白,蛋白质分子量为17k D,由154个氨基酸组成,HBx是在哺乳动物中高度保守的区域。肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,占癌症死亡率第二位,严重威胁着人们的健康。在我国80%肝细胞癌的发生与HBV的感染相关,HBx保守的存在于病毒DNA中,而且有一些研究认为在没有HBV复制的情况下,HBx仍表达于肝细胞癌细胞中[3]。HBx广泛的参与细胞的生物学过程,起到转录激活作用、表观遗传调控、细胞凋亡调节、DNA修复调节的作用,在HCC发生发展过程中,起到促进肝癌细胞增殖、转移和侵袭的作用,因此HBx被认为是与HCC发生发展过程中的重要调节蛋白。文章的第一章我们构建了磷酸化蛋白质组学的方法,对正常小鼠的磷酸化蛋白质组学数据进行了收集和分析,并对该方法进行了评估。我们对小鼠肝脏进行FASP酶切,再利用Ti O2对于酶切后的肽段进行富集,我们对酶切后的肽段进行分离,以提高Ti O2富集磷酸化肽时的效率,最后对富集后的磷酸化肽段进行质谱分析。利用该方法,我们鉴定到了1271个磷酸化蛋白、5386磷酸化位点和4553磷酸化肽段,并对鉴定到的磷酸化修饰蛋白进行GO分析、Motif分析、激酶分类、新鉴定到的激酶磷酸化位点的分析。蛋白激酶抑制剂在癌症治疗时也是主要和高效的药物,文章中对于新的激酶位点的挖掘,可以为蛋白激酶抑制剂的发现提供有价值的信息,也为探讨和研究磷酸化修饰蛋白在肝脏生理病理过程中发挥的重要作用奠定了坚实的基础。在文章的第二章中,我们首次对HBx转基因肝癌小鼠肝脏和正常小鼠肝脏进行大规模高通量的差异磷酸化蛋白质组学分析,并且得到了差异的磷酸化蛋白的数据,并对数据进行了进一步的挖掘和分析。在我们的研究中,利用HBx基因定点插入的小鼠模型,并且生长到24个月的时候HBx基因型的小鼠形成了肝细胞癌,通过病理切片和RT-PCR的检测,我们确认小鼠模型构建成功。利用该模型,我们对24月龄的HBx基因型小鼠和野生型小鼠进行了基于SILAC的磷酸化蛋白质组差异分析。利用HBx基因定点插入的24月龄小鼠肝癌模型和24月龄野生型小鼠模型的差异磷酸化蛋白质组的比较,我们发现了功能重要的PDK1和WNK1两个激酶。在我们鉴定到数据中发现在HBx组PDK1和WNK1的磷酸化水平发生明显的上调,所以我们重点关注了这两个激酶与HBx的关系,并且构建了HBx瞬时表达和稳定表达细胞株来进一步阐述HBx对于PDK1的调控,发现在HBx过表达的细胞系中,p-PDK1发生明显的上调,同时p-WNK1的磷酸化也发生明显的上调。根据目前已有的研究,我们知道PDK1参与调控细胞增殖,当我们用PI3K和PDK1的激酶抑制剂处理细胞时,细胞增殖会被有效抑制,然而在稳定表达HBx的细胞中,PI3K和PDK1的抑制剂的效果会减弱,并且p-PDK1和p-WNK1会有剂量依赖性的下调,所以可以得出结论,HBx能够有效抑制PI3K和PDK1抑制剂的抑制增殖的作用,并且很有可能是通过PDK1/WNK1这条通路来发挥抑制增殖作用的。在HBV相关的HCC的临床样本中,我们对我们的假设进行进一步的验证,发现在HBV阳性的HCC中,相比于癌旁组织p-PDK1发生了显著的上调。我们利用差异磷酸化蛋白质组学的方法对肝癌小鼠和正常小鼠进行了组学分析,并对得到的差异蛋白进行了深度的挖掘,对于得到的差异蛋白进行了调研,并提出了相关的假设,并且验证了HBx对于PDK1的调控。
【关键词】：磷酸化 蛋白质组学 肝脏 HBx 肝细胞癌 PDK1
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 英文缩写词对照表5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-19
• 第一章小鼠肝脏磷酸化蛋白质组方法构建19-34
• 1.1 材料与方法19-20
• 1.1.1 实验材料和仪器19-20
• 1.1.2 实验动物20
• 1.2 实验方法20-22
• 1.2.1 C57BL/6J小鼠肝脏蛋白质提取20
• 1.2.2 小鼠肝脏蛋白酶切20-21
• 1.2.3 TiO2富集磷酸化肽段21
• 1.2.4 HPLC分离磷酸化肽段21
• 1.2.5 磷酸化肽段质谱鉴定21-22
• 1.2.6 数据库检索22
• 1.3 结果与讨论22-32
• 1.3.1 正常小鼠肝脏磷酸化蛋白质组数据集22-25
• 1.3.2 激酶磷酸化位点分析25-30
• 1.3.3 模序富集分析30-32
• 1.4 小结32-34
• 第二章HBx通过调控PDK1 磷酸化参与HCC发生34-46
• 2.1 材料与方法34-35
• 2.1.1 实验试剂和材料34-35
• 2.1.2 仪器设备35
• 2.2 实验方法35-40
• 2.2.1 RT-PCR检测24月龄小鼠模型HBx表达35-38
• 2.2.2 小鼠肝脏组织样品制备38
• 2.2.3 HBx组和WT组小鼠肝脏蛋白酶切、富集、分离（方法同第一章）38
• 2.2.4 数据库检索和数据质控38-39
• 2.2.5 蛋白印迹实验Western Bloting39
• 2.2.6 CCK-8 检测细胞增殖39
• 2.2.7 免疫共沉淀Co-IP39-40
• 2.2.8 数据分析40
• 2.3 结果40-46
• 2.3.1 小鼠模型评价40
• 2.3.2 定量磷酸化蛋白质组学数据产出40
• 2.3.3 重要磷酸化蛋白的筛选40-41
• 2.3.4 HBx过表达诱导PDK1 磷酸化水平上调41-42
• 2.3.5 HBx减弱PI3K和PDK1 抑制剂的作用42-43
• 2.3.6 HBx减弱了PI3K和PDK1 抑制剂的抑制增殖作用43-45
• 2.3.7 P-PDK1 在HCC临床样本中的验证45-46
• 2.4 小结46
• 总结46-48
• 文献综述48-54
• 参考文献54-63
• 附录63-103
• 致谢103

【共引文献】

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本文编号：709644