用于肿瘤个体化医疗的3D细胞培养模型的建立及特点研究

发布时间：2017-08-21 21:40

  本文关键词：用于肿瘤个体化医疗的3D细胞培养模型的建立及特点研究

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【摘要】：二维细胞培养模型(Two dimensional cells culture model,2D culture)缺乏源组织微环境导致细胞结构与体内存在显著差异,从而导致药物响应模式及信号分子通路的表达与生物体内显著不同。动物实验周期长,操作复杂,实验成本高并且存在个体性差异,不利于临床应用。肿瘤细胞三维培养模型(Three dimensional cells culture model, 3D culture)可模拟体内肿瘤细胞生长微环境,使体外肿瘤细胞生长和相关信号通路的调控近似源组织。在本课题中,我们试图建立可用于肿瘤个体化医疗的前列腺癌细胞3D培养模型。主要研究内容及结果如下：1.建立基于Matrigel的前列腺癌细胞3D培养模型。分析基于Matrigel的3D培养模型的PC3细胞形态学和增殖动力学,结果发现PC3细胞在Matrigel基质中形成了类似于源组织的枝节状腺体组织结构的致密肿瘤细胞球体,PC3细胞在Matrigel基质中增生并在长时间内保持高活力,这一结果近似肿瘤细胞在体内的生长特点。此外,通过检测13种抗肿瘤药物对PC3细胞的增殖抑制作用并计算IC50,结果发现有11个药物对2D培养模型和基于Matrigel的3D模型的PC3细胞的IC50值存在显著差异。PC3细胞在Matrigel基质中具有明显的药物不敏感性。2.进一步建立基于Alginate-HA的前列腺癌细胞3D微载体球培养模型,为今后建立可用于流式细胞仪检测的3D培养模型奠定基础。在研究中比较2D培养模型和基于Alginate-HA的3D微载体球培养模型的前列腺癌细胞形态学、生长因子(IL-8和VEGF)、基质金属蛋白酶MMPs (MMP-2, MMP-3, MMP-9)、EMT过程生物标志物(N-Cadherin, Vimentin、β6 integrin)及凋亡蛋白caspase-3的表达水平,结果显示,前列腺癌细胞在Alginate-HA微载体球中1L-8和VEGF表达水平显著上调,肿瘤细胞恶性表型显著增强。此外,MMPs及EMT过程生物标志物的表达水平大幅度上调,表明肿瘤细胞在Alginate-HA微载球中侵袭和转移潜力显著增强,在一定程度上重现了体内肿瘤细胞的侵袭和转移模式。经过药物处理后,微载体球中3D细胞的caspase-3活性明显低于2D细胞,具有明显的凋亡耐受性。3.前列腺癌细胞体内外培养模型药效学一致性评价。本研究分析2D培养模型、基于Matrigel的3D培养模型、基于Alginate-HA的3D微载体球培养模型和裸鼠移植瘤模型经药物处理后caspase-3和Bcl-2的活性。结果发现两种3D培养模型和体内模型的凋亡程度接近,并且明显比2D培养模型具有更强的凋亡耐受性。这表明,两种3D培养模型药物应答模式与体内相似,可用于替代动物实验进行抗肿瘤药物药效评价。此外,基于Matrigel的3D培养模型价格昂贵,而基于Alginate-HA的3D微载体球培养模型的成本仅约为其1/3,并且有望在未来的研究中开发出能用于流式细胞检测和微流控的三维细胞培养模型,更适合于肿瘤个性化用药指导。创新点：本文首次应用Alginate-HA微载体球对前列腺癌细胞进行3D培养,并且第一次系统评价2D培养模型、3D培养模型和体内模型对临床常用抗癌药物响应的一致性,建立了用于肿瘤个体化医疗的药物敏感度检测的3D培养模型。
【关键词】：前列腺癌 3D培养 裸鼠移植瘤 Matrigel Alginate-HA
【学位授予单位】：广东工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-16
• 第一章 绪论16-29
• 1.1 引言16-17
• 1.2 3D培养技术17-20
• 1.2.1 3D培养技术的定义17-18
• 1.2.2 2D培养和器官型培养的局限性18-19
• 1.2.3 3D培养的优势19-20
• 1.3 3D培养方法20-21
• 1.3.1 细胞自发性聚集20
• 1.3.2 液体覆盖培养20-21
• 1.3.3 微载体珠培养21
• 1.3.4 预制支架培养21
• 1.3.5 旋转烧瓶培养21
• 1.3.6 旋转细胞培养系统21
• 1.4 在3D培养中重构肿瘤微环境21-26
• 1.4.1 肿瘤-基质的交互作用22-24
• 1.4.2 细胞-细胞间黏附及信号分子24-26
• 1.5 3D培养技术在肿瘤研究领域的应用26-27
• 1.5.1 在肿瘤个体化医疗方面的应用26-27
• 1.5.2 在肿瘤耐药性研究方面的应用27
• 1.5.3 在肿瘤微血管形成方面研究的应用27
• 1.6 本论文研究的目的、意义和内容27-29
• 第二章 基于Matrigel的前列腺癌3D培养模型的建立和验证29-45
• 2.1 前言29-30
• 2.2 实验部分30-38
• 2.2.1 实验仪器与试剂30-31
• 2.2.2 细胞2D培养31-33
• 2.2.3 MTT比色法测定细胞生长曲线33-34
• 2.2.4 基于Matrigel的细胞3D培养34-35
• 2.2.5 台盼蓝拒染法35-36
• 2.2.6 WST-8法36-38
• 2.2.7 数据统计与分析38
• 2.3 实验结果38-43
• 2.3.1 前列腺癌细胞生长曲线38-39
• 2.3.2 3D培养细胞形态学分析39-40
• 2.3.3 细胞增殖分析40-41
• 2.3.4 药物对PC3细胞的增殖毒性分析41-43
• 2.4 小结与讨论43-45
• 第三章 基于Alginate-HA的前列腺癌3D培养模型的建立和验证45-71
• 3.1 前言45-46
• 3.2 实验部分46-55
• 3.2.1 实验仪器与试剂46-48
• 3.2.2 细胞2D培养48
• 3.2.3 基于Alginate-HA的细胞3D培养48-49
• 3.2.4 苏木精-伊红染色(H.E.染色)49-50
• 3.2.5 酶联免疫吸附法(ELISA)50-52
• 3.2.6 免疫荧光染色法(IF)52-53
• 3.2.7 荧光素酶法测定caspase-3含量53-54
• 3.2.8 数据统计与分析54-55
• 3.3 实验结果55-67
• 3.3.1 细胞形态学分析55-57
• 3.3.2 肿瘤恶性表型生长因子表达分析57-59
• 3.3.3 EMT过程分子标志物的表达59-67
• 3.4 基于Alginate-HA的3D培养的细胞具有更强的凋亡耐受性67-69
• 3.5 小结与讨论69-71
• 第四章 体内外模型药效学一致性评价71-83
• 4.1 前言71-72
• 4.2 实验部分72-75
• 4.2.1 实验仪器及试剂72-73
• 4.2.2 裸鼠移植瘤模型的建立及抗肿瘤药物对其抑制作用研究73
• 4.2.3 免疫组织化学法(IHC)73-74
• 4.2.4 凋亡蛋白表达量测定74-75
• 4.3 数据统计与分析75
• 4.4 实验结果75-81
• 4.4.1 抗肿瘤药物对PC3细胞裸鼠移植瘤的抑制作用75-77
• 4.4.2 免疫组化阳性率分析77-79
• 4.4.3 肿瘤细胞体内外培养模型的细胞凋亡情况分析79-81
• 4.5 小结与讨论81-83
• 总结与展望83-85
• 参考文献85-95
• 攻读硕士研究生期间发表的论文与专利95-97
• 致谢97

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本文编号：715301