白念珠菌诱导人单核细胞白血病细胞（THP-1细胞）固有免疫应答机制的初步研究

发布时间：2017-08-24 16:25

  本文关键词：白念珠菌诱导人单核细胞白血病细胞（THP-1细胞）固有免疫应答机制的初步研究

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【摘要】：第一章人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)吞噬作用研究目的研究人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)对墨汁、白念珠菌的吞噬情况,初步探讨肌动蛋白在吞噬过程中的作用。方法以丙二醇甲醚醋酸酯(Propylene glycol monomethyl ether acetate,PMA)诱导THP-1细胞为巨噬细胞,分别以适量墨汁、灭活的白念珠菌菌悬液与其进行共培养,观察THP-1细胞吞噬情况。并以细胞松弛素-B(Cytochalasin-B,Cyt-B)对THP-1细胞预处理后,观察细胞对白念珠菌吞噬情况。结果经PMA诱导后的THP-1细胞形态发生变化,出现胞对培养瓶的附着,并有多形性的细胞形状。与墨汁、白念珠菌共培养后可见细胞内出现大量墨汁、白念珠菌成分。经Cyt-B预处理后的细胞不能吞噬白念珠菌,仅可见少量白念珠菌与细胞黏附。结论THP-1细胞经诱导为巨噬细胞后具有吞噬功能,白念珠菌可被诱导后的THP-1细胞吞噬；吞噬过程的发生依赖肌动蛋白的聚集。第二章白念珠菌诱导人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)产生前炎症因子的初步研究目的研究白念珠菌对THP-1细胞分泌TNF-α、IL-6等前炎症因子的影响。方法实时荧光定量PCR分析不同浓度(105 CFU/ml.106 CFU/ml)灭活白念珠菌。脂多糖(LPS)刺激THP-1细胞后TNF-α、IL-6的mRNA表达水平变化；并以酶联免疫吸附法检测THP-1细胞与106 CFU/ml灭活白念珠菌、LPS共培养后TNF-α、IL-6的分泌量。结果105 CFU/ml白念珠菌组、106 CFU/ml白念珠菌组、阳性刺激物脂多糖(LPS)刺激THP-1细胞组以及空白对照组的TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表达水平进行双因素方差分析,结果显示不同组别的TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表达水平有差异(F=110.983,P0.001；F=294.114,P0.001)；刺激1、3、6h之间也有统计学意义(F=701.680,P0.001;F=1036.557,P0.001) ;提示在6h内白念珠菌上调TNF-α mRNA、IL-6 mRNA水平随时间延长而增高,且白念珠菌组上调TNF-α mRNA、IL-6 mRNA水平表现为剂量依赖效应。106 CFU/ml白念珠菌刺激后24 h,白念珠菌组、LPS组、培养基对照组的上清液中TNF-α蛋白浓度分别为(6385.70±533.99)ng/L、(3212.06±353.00)ng/L、(147.10±0.53)ng/L,三者之间差异有统计学意义(n=8,F=71.25,P0.01),白念珠菌组、LPS组分别与培养基对照组比较,TNF-α蛋白分泌量均明显升高,差异有统计学意义(P分别为0.01、0.05)。106 CFU/ml白念珠菌刺激后24 h,白念珠菌组、LPS组、培养基对照组的上清液中IL-6蛋白浓度分别为(924.90±30.13)ng/L、(286.10±6.12)ng/L、(10.47±0.07)ng/L,三者之间差异有统计学意义(n=8,F=61.27,P0.01),白念珠菌组、LPS组分别与培养基对照组比较,IL-6蛋白分泌量均明显升高,差异有统计学意义(P分别为0.01、0.01)。结论THP-1细胞体外与白念珠菌作用后分泌TNF-α、IL-6水平明显增高,且呈现剂量依赖效应与时间依赖效应,从而参与抗念珠菌感染固有免疫反应。第三章白念珠菌诱导活化人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)信号通路的初步研究目的探讨白念珠菌对THP-1细胞内信号分子p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子κB (NF-κB)激活的影响。方法免疫印迹法分析106 CFU/ml灭活白念珠菌体外作用THP-1细胞30min、1h后p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平及IκBα和磷酸化IκBα的水平。以106 CFU/ml灭活白念珠菌菌悬液、LPS刺激THP-1细胞后,以免疫荧光法观察NF-κB核转位。同时设置地塞米松抑制组,以同样的方法检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平；并以实时荧光定量PCR法检测地塞米松预处理后THP-1细胞TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表达水平的变化。结果106 CFU/ml白念珠菌作用于THP-1细胞30min、60 min后磷酸化p38MAPK、磷酸化IKBa蛋白水平明显升高。培养基对照组中,p65处于细胞质内；白念珠菌及LPS诱导刺激后,核内出现p65。地塞米松抑制组可降低白念珠菌对磷酸化P38MAPK的激活水平。40 gg/L地塞米松预先与THP-1细胞共培养30 min后,再以106 CFU/ml白念珠菌刺激6 h检测TNF-α mRNA表达水平(3.77±0.62)较未用地塞米松组(208.50±10.50)明显降低,IL-6 mRNA表达水平(12.66±1.63)较未用地塞米松组(584.43±16.80)明显降低。地塞米松可阻断白念珠菌上调TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表达水平。结论THP-1细胞体外与白念珠菌作用后可激活信号分子p38MAPK、NF-κB,并分泌TNF-α、IL-6等前炎症因子,参与抗念珠菌感染固有免疫反应。第四章白念珠菌诱导人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)C型凝集素-I受体(Dectin-1)表达的初步研究目的探讨白念珠菌刺激THP-1细胞后能否引起Dectin-1受体表达量发生变化。方法流式细胞术检测THP-1细胞经不同时间点灭活白念珠菌菌悬液、Curdlan(一种p-葡聚糖)刺激后Dectin-1受体的表达水平。结果白念珠菌、Curdlan刺激THP-1细胞3h后,Dectin-1受体表达量较对照组无明显变化,自6h起其表达量逐渐升高,6h组、12h组、24h组与对照组相比均有统计学差异(P0.05);且白念珠菌上调Dectin-1受体表达水平呈时间-效应关系,随着刺激时间的延长,表达量逐渐升高,至24h仍处于较高水平。结论THP-1细胞体外与白念珠菌作用后可促使Dectin-1受体表达量增高。THP-1细胞可能通过增高Dectin-1受体的表达水平,并活化下游信号分子通路,从而发挥抗白念珠菌的固有免疫反应。
【关键词】：白念珠菌 单核巨噬细胞 肿瘤坏死因子α 白细胞介素6 p38丝裂原活化蛋白激酶 核因子κB C型凝集素-1受体
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.7
【目录】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-16
• 参考文献14-16
• 第一章 人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)吞噬作用的初步研究16-26
• 引言16
• 材料和方法16-19
• 结果19-22
• 讨论22-23
• 参考文献23-26
• 第二章 白念珠菌诱导人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)产生前炎症因子的初步研究26-36
• 引言26
• 材料和方法26-30
• 结果30-32
• 讨论32-34
• 参考文献34-36
• 第三章 白念珠菌诱导活化人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)信号通路的初步研究36-48
• 引言36
• 材料和方法36-40
• 结果40-44
• 讨论44-46
• 参考文献46-48
• 第四章 白念珠菌诱导人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)C型凝集素-1受体表达的初步研究48-56
• 前言48
• 材料和方法48-50
• 结果50-53
• 讨论53-55
• 参考文献55-56
• 全文小结56-58
• 论文相关综述58-66
• 参考文献62-66
• 在读期间发表文章66-68
• 致谢68-70

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本文编号：732333