高危人乳头瘤病毒16型、18型E6蛋白重组表达及单克隆抗体制备

发布时间：2017-08-25 05:30

  本文关键词：高危人乳头瘤病毒16型、18型E6蛋白重组表达及单克隆抗体制备

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【摘要】：宫颈癌是世界范围内女性患者中第二多发的癌症,具有较高的致病率和致死率。女性宫颈癌的发生发展是因为长期受到高风险性人乳头瘤病毒(HPV)感染。人乳头瘤病毒是最广泛的性传播病毒,有超过100种HPV病毒变种。在世界范围内,引起宫颈癌最多的是16型、18型两种,占到70%以上。而另外常见的两种低风险性的6型、11型则会引起男性生殖器疣。HPV是无外壳的dsDNA病毒,基因组为环状,大约有8000 bp。编码8种蛋白,其中6个早期蛋白,2个晚期蛋白。从HPV感染宫颈鳞状上皮细胞开始,到病毒持续存在上皮细胞,并使宿主细胞转化为肿瘤细胞的过程中,E6蛋白扮演着至关重要的角色。在宫颈上皮内瘤变(CIN)各个分期中,E6蛋白均有表达,并随着病程发展,逐渐增多。研究表明,E6蛋白在CIN Ⅰ期,CINⅡ期,CINⅢ期中的阳性率分别为75%、88.25%、100%。因此,针对16、18型E6基因及其基因产物的检测是早期发现宫颈癌和作为宫颈癌病程发展的重要指标。目前市场上检测HPV的方法主要有分子生物学方法,包括核酸杂交方法、基于信号放大的分析方法如Digene公司的HC2试剂盒、核酸扩增方法。核酸杂交的方法缺点是灵敏度低、需要大量纯度高的DNA样本、程序耗时长,不可以分型。而基于核酸扩增的方法样本要求少,可以分型,灵敏度高,但是由于HPV具有一过性感染的特性,检测结果容易出现假阳性,并且由于需要扩增过程,从而导致对检测环境要求较高,检测时间较长,检测成本较高。而针对HPV16型、18型E6蛋白的检测不仅灵敏度高,成本低,重复性好,还能反应病毒的真实活动情况,并且可以为临床子宫颈病变诊断分期提供帮助。本研究首先利用设计的针高危HPV16型、18型病毒的特异性引物从宫颈癌病变组织中提取HPV的基因组DNA中扩增出16型、18型E6蛋白基因；然后通过分子克隆的方法,将E6蛋白基因构建到表达载体PET28a和PET32a上,转入宿主菌BL21(DE3)中,进行原核表达；随后利用镍柱纯化HPV16型E6蛋白和HPV18型E6蛋白并复性；最后将得到的纯化的蛋白免疫Babl/c小鼠。通过血清效价检测,选择高效价的经PET28a-HPV16 E6和 PET28a-HPV18 E6两种蛋白免疫的小鼠,通过细胞融合、筛选及克隆化工作,制备相应的单克隆抗体。最终筛选到特异性针对HPV18E6的细胞株HPV18E6/3-7D,能够特异性针对HPV18E6重组蛋白的单克隆抗体,经过特异性实验分析,结果发现该抗体不与HPV16E6蛋白、表达系统蛋白、HepG2细胞蛋白发生交叉反应。本研究制备了特异性针对HPV18E6蛋白的单克隆抗体,下一步可以用临床病人样本对该单抗进一步验证,并结合化学发光或纳米技术开发新型免疫检测分析方法。
【关键词】：人乳头瘤病毒16型 人乳头瘤病毒18型 E6蛋白 重组表达 单克隆抗体
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 英文缩略词表5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 第一章 综述11-22
• 1.1 人乳头瘤病毒概述11-16
• 1.1.1 HPV感染与宫颈癌关系12-13
• 1.1.2 HPV基因结构及功能13-14
• 1.1.3 HPV早期蛋白E6/E7的功能及其分子机制14-16
• 1.2 人乳头瘤病毒检测方法16-20
• 1.2.1 病理、细胞学、组化检查16
• 1.2.2 分子生物学方法检测HPV16-19
• 1.2.3 酶联免疫吸附分析技术检测HPV19-20
• 1.3 研究目的和内容20-22
• 1.3.1 人乳头瘤病毒16型、18型E6蛋白重组质粒构建20
• 1.3.2 人乳头瘤病毒16型、18型E6蛋白原核表达及纯化20
• 1.3.3 人乳头瘤病毒18型E6蛋白单克隆抗体制备及鉴定20-22
• 第二章 HPV16型、18型E6蛋白重组质粒构建22-29
• 2.1 实验材料及方法22-26
• 2.2 实验结果26-28
• 2.2.1 PCR扩增HPV 16型、HPV 18型E6蛋白基因26
• 2.2.2 阳性克隆的筛选26-28
• 2.3 讨论28-29
• 第三章 HPV16型、18型E6蛋白原核表达及纯化29-46
• 3.1 实验材料及方法29-35
• 3.2 实验结果35-43
• 3.2.1 PET28a-16E6、PET28a-18E6蛋白表达35-36
• 3.2.2 IPTG浓度对PET28a-18E6表达影响36-37
• 3.2.3 时间对PET28a-18E6表达影响37
• 3.2.4 温度对PET28a-18E6表达影响37-38
• 3.2.5 PET28a-16E6蛋白、PET28a-18E6蛋白纯化38-39
• 3.2.6 Western blotting分析PET28a-16E6蛋白、PET28a-18E6蛋白表达39
• 3.2.7 IPTG浓度对PET32a-18E6表达影响39-40
• 3.2.8 时间对PET32a-18E6表达影响40
• 3.2.9 温度对PET32a-18E6表达影响40-41
• 3.2.10 Western blotting分析PET32a-16E6蛋白、PET32a-18E6蛋白表达41-42
• 3.2.11 包涵体蛋白复性42-43
• 3.3 讨论43-46
• 第四章 HPV16型、18型E6蛋白单克隆抗体制备及鉴定46-57
• 4.1 实验材料及方法47-52
• 4.2 实验结果52-56
• 4.2.1 小鼠血清效价测定52-53
• 4.2.2 单克隆筛选及克隆化53-54
• 4.2.3 Western blotting鉴定单克隆抗体特异性54
• 4.2.4 ELISA验证抗体特异性54-56
• 4.3 讨论56-57
• 参考文献57-63
• 附录63-65
• 攻读硕士期间发表文章和成果65-66
• 致谢66-67

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本文编号：735344