PNPLA3基因I148M多态性对肝癌细胞Huh-7细胞周期的影响

发布时间：2017-08-27 22:33

  本文关键词：PNPLA3基因I148M多态性对肝癌细胞Huh-7细胞周期的影响

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【摘要】：目的构建稳定表达PNPLA3基因野生型和PNPLA3基因I148M突变型的Huh-7细胞株,在此基础上探讨PNPLA3基因I148M多态性对人Huh-7细胞周期的影响及相关机制。方法双酶切PNPLA3基因野生型及PNPLA3基因I148M突变型的基因序列与载体序列,并使目的基因分别与载体连接,纯化并扩增获得含有目的基因的载体质粒;获得的载体质粒和病毒辅助包装质粒共转染293T细胞,获得携带目的基因的高滴度的慢病毒;慢病毒转染Huh-7细胞,筛选并构建稳定表达PNPLA3基因野生型和PNPLA3基因I148M突变型的Huh-7细胞株;在此基础上以空载体Huh-7细胞为对照,流式细胞术检测转染的Huh-7细胞周期,Western blot方法及荧光定量PCR分别检测细胞周期调节因子Cyclin D1及p53的表达情况。统计学处理采用SPSS 17.0软件,定量资料的数据均以“均数±标准差”表示,两组间比较分别采用独立样本t检验或χ2检验;P0.05为差异有统计学意义。结果(1)成功构建载体质粒:阳性克隆菌液进行测序,测序结果证实载体质粒携带目的基因完整编码序列。(2)慢病毒载体构建成功并获得足够滴度(1×10^8PFU/ml)的慢病毒载体:倒置荧光显微镜下显示携带目的基因的慢病毒载体在293T细胞中成功组装,嘌呤霉素筛选后表达出明亮的绿色荧光蛋白。(3)慢病毒成功感染Huh-7细胞:倒置荧光显微镜下显示嘌呤霉素筛选后绿色荧光蛋白阳性表达率95%;Western blot结果显示突变型组与野生型组目的蛋白的表达明显高于对照组;荧光定量PCR结果显示突变型组及野生型组PNPLA3 mRNA的相对表达(突变型166.65±117.25,野生型1149.55±278.17)分别明显高于对照组(1.02±0.23,P0.05)。(4)PNPLA3基因I148M多态性导致Huh-7细胞周期紊乱:三组间各细胞周期细胞所占比例(%)的两两比较显示野生型组细胞周期G1期(58.53±0.35),G2/M期(24.87±0.60),S期(16.60±0.26)参数与对照组对应各期(G1期59.27±0.15;G2/M期24.23±0.31;S期16.50±0.26)之间差异无统计学意义;突变型组与野生型组相比,G1期细胞比例减少(突变型G1期38.37±0.21,P0.05),S期与G2/M期细胞比例相应增加(突变型S期27.47±0.35,G2/M期34.17±0.15,P0.05)。(5)周期相关蛋白P53表达显著增强,Cyclin D1表达水平无明显差异:与对照组相比,突变型组的P53 mRNA相对表达量明显上调(对照组1.06±0.41,突变型组6.54±0.34;P0.05);野生型组P53 mRNA相对表达量差异无统计学意义(1.66±0.30,P0.05)。Cyclin D1 mRNA各组中的相对表达量均无明显差异(对照组1.00±0.10,野生型组1.06±0.03,突变型,1.11±0.04;P0.05)。结论PNPLA3基因I148M突变可能促进Huh-7细胞DNA的复制,加速细胞周期,从而促进肝癌细胞生长。上调p53的表达参与了此过程。
【关键词】：慢病毒 PNPLA3 I148M 细胞周期 p53
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-7
• 引言7-9
• 第1章 构建稳定表达目的基因的Huh-7 细胞系9-21
• 1.1 实验材料9-11
• 1.1.1 主要仪器和设备9
• 1.1.2 主要试剂和器材9-11
• 1.2 实验方法11-21
• 1.2.1 Huh-7 细胞的培养11-12
• 1.2.2 目的基因过表达慢病毒的构建12-15
• 1.2.3 慢病毒载体构建15-17
• 1.2.4 慢病毒包装17-18
• 1.2.5 慢病毒转染Huh-7 细胞18-19
• 1.2.6 验证目的基因的表达19-21
• 1.2.6.1 Western Blot验证PNPLA3蛋白的表达19-20
• 1.2.6.2 荧光定量PCR验证PNPLA3基因mRNA的表达20-21
• 第2章 PNPLA3基因I148M多态性对Huh-7 细胞周期的影响21-24
• 2.1 实验材料21-22
• 2.2 实验方法22-24
• 2.2.1 细胞周期的测定22
• 2.2.2 Western Blot测定周期相关蛋白的表达22
• 2.2.3 荧光定量PCR测定周期相关蛋白mRNA的表达22-24
• 第3章 结果24-33
• 3.1 载体质粒构建成功24-28
• 3.2 慢病毒载体构建成功28-29
• 3.3 慢病毒成功感染Huh-7 细胞29-30
• 3.4 PNPLA3成功过表达30-31
• 3.5 PNPLA3基因I148M多态性影响Huh-7 细胞的细胞周期31-32
• 3.6 Western blot检测p53，cyclin D1蛋白的表达32
• 3.7 荧光定量PCR检测P53，cyclin D1 mRNA相对表达32-33
• 第4章 讨论33-34
• 第5章 结论34-35
• 参考文献35-39
• 综述39-50
• 综述参考文献43-50
• 攻读学位期间的研究成果50-51
• 缩略词51-52
• 致谢52-53

【参考文献】

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1 徐静;辛永宁;宣世英;;PNPLA3基因多态性与非酒精性脂肪性肝病关系的研究进展[J];临床肝胆病杂志;2012年04期

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本文编号：746197