利用滤除白细胞分离培养NK细胞方法的优化

发布时间：2017-08-28 01:21

  本文关键词：利用滤除白细胞分离培养NK细胞方法的优化

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【摘要】：目的:利用制备血制品过程的滤除掉的淋巴细胞经体外诱导扩增NK细胞,对NK细胞的分离培养方法进行优化,并对培养以后所获得的NK细胞的功能和活性进行检测,为非自体NK细胞的临床应用提供实验室研究数据。方法:收集山西省血液中心2014年3月至2014年11月期间15例健康献血者的新鲜外周血,将制备血液制品后废弃的滤除白细胞回收,经过密度梯度离心法获得外周血中单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),每份样本分为3组,A组:培养瓶预先包被CD3m Ab;B组:培养瓶预先包被CD16m Ab;C组:培养瓶预先包被CD16m Ab和CD3m Ab,相同培养条件下,加入相同无血清细胞培养液和细胞因子IL-2和IFN-γ诱导扩增。扩增第0、8、12、17天高倍镜下看细胞长势并计算细胞扩增倍数,用流动检测细胞技术检测细胞表型为CD3-CD56+的细胞比例的变化,选择NK占比最高的B组细胞成为实验对象,分别测定培养第0天和第17天B组NK细胞表面高活性受体(NKp30、NKp46、NKG2D)的表达及细胞杀伤因子IFN-γ的分泌水平,培养第17天采用LDH释放法及流式细胞术检测B组NK细胞对恶性细胞K562和Raji细胞的细胞毒作用。结果:比较诱导培养第17天与培养第0天的CD3-CD56+细胞占比的变化情况,A组为[(15.19±12.22)%vs(16.34±10.51)%,p0.05],差异无统计学意义,B组为[(83.63±10.63)%vs(16.34±10.51)%,p0.05],C组为[(49.40±12.64)%vs(16.34±10.51)%,p0.05],B和C组培养第17天的CD3-CD56+细胞比例均较第0天显著增加,差异具有统计学意义;第17天CD3-CD56+细胞比例B组比例显著高于A和C组;三组NK细胞总数均大于109个;检测B组培养第17天NK表面活化性受体NKp30和NKp46的表达比例均比第0天显著增高,NKG2D比例变化无统计学意义;B组扩增的NK细胞对K562细胞和Raji细胞均具有杀伤能力,对K562细胞具有较高的杀伤能力。结论:制备血液制品后滤除掉的白细胞,安全可靠,无病原体污染,经体外分离培养后,可得到比例高达90%的NK细胞,其总数大于109个,细胞杀伤能力增强,对恶性肿瘤细胞具有较高杀伤能力,达到临床治疗恶性疾病的应用标准,滤除白细胞有希望成为临床非自体NK细胞防治恶性肿瘤的一种细胞来源;NK细胞扩增过程中经过密度梯度离心法分出外周血单个核细胞,再添加单克隆抗体和细胞因子诱导扩增,培养过程简便,成本较低,适用于临床大规模应用。
【关键词】：NK细胞 同种异体 血液制品 分离培养
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.51
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 常用缩写词中英文对照表9-11
• 前言11-14
• 1 材料与方法14-19
• 1.1 实验材料14-15
• 1.2 实验方法15-18
• 1.3 统计学分析18-19
• 2 结果19-26
• 2.1 培养前后NK细胞形态学变化19
• 2.2 NK细胞表型检测和扩增情况19-21
• 2.3 NK细胞表面活化性受体表达率检测21-22
• 2.4 NK细胞分泌IFN-γ水平22-23
• 2.5 NK细胞作用前后肿瘤细胞的形态变化23-24
• 2.6 NK细胞对不同肿瘤细胞杀伤作用比较24-26
• 3 讨论26-29
• 4 结论29-30
• 参考文献30-34
• 综述34-48
• 参考文献41-48
• 致谢48-49
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果49-50
• 个人简历50

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 Chávez-Galán L;Arenas-Del Angel MC;Zenteno E;Chávez R;Lascurain R;;Cell Death Mechanisms Induced by Cytotoxic Lymphocytes[J];Cellular & Molecular Immunology;2009年01期

2 周智锋;李洁羽;陈明水;叶韵斌;;细胞因子组合体外扩增人NK细胞的研究[J];中华肿瘤防治杂志;2014年03期

3 吴长有;刘杰;杨滨燕;Mario Roedere;;人外周血CD56~+NK细胞亚群表型和生物学特征[J];中华肿瘤杂志;2006年03期

4 张慰慈,张建;人NK细胞系的建立及其在肿瘤生物治疗中的应用前景[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2002年03期

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本文编号：746687