新型荧光探针检测平台的构建及其在miRNA-21和UDG检测中的应用

发布时间：2017-08-28 02:16

  本文关键词：新型荧光探针检测平台的构建及其在miRNA-21和UDG检测中的应用

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【摘要】：近年来,荧光分子探针技术基于灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,已经广泛应用于化学、医学和生物学等领域。本论文通过设计和合成多种靶向性新型分子信标,在对其性能进行研究的基础上,将其应用到复杂生物样品中的靶分子定量检测、分析,结合经典分子生物学研究手段进一步探讨分子信标在临床生物大分子检测和诊断中的潜在应用价值。本文的主要研究内容如下:1.分子信标用于肿瘤相关的miRNA-21表达水平的快速、简单检测本章以根据miRNA-21序列组成设计合成可特异性识别miRNA-21的分子信标为工具,发展了一种基于分子信标直接在总RNA中检测miRNA-21的方法。在利用荧光波长扫描技术考察了分子信标的热稳定性、杂交性能和特异性以及信标与靶分子杂交条件优化的基础上,将该技术直接用于培养的肿瘤细胞和人胃癌组织中的miRNA-21表达水平检测。结果发现:具有良好的杂交性能和特异性的分子信标检测标准样品的下限可达到0.5 n M,能够快速实现肿瘤细胞和组织中的miRNA表达水平差异性检测,结果表明:在17例标本胃癌组织中有10例(59%)miRNA-21表达水平高于癌旁组织;检测结果的可靠性进一步通过q RT-PCR进行验证;此外,采用Western blotting对miRNA-21直接调控的目的基因PDCD4和PTEN表达水平进行检测,发现其蛋白表达与miRNA-21表达趋势呈负相关。2.基于分子信标结合酶促信号放大用于miRNA-21的超灵敏检测本章目的是利用设计和合成茎部为RNA的新型嵌合分子信标建立一种基于双重信号放大系统超灵敏检测miRNA的新方法。在通过荧光法考察该分子信标的稳定性、抗酶切能力以及杂交条件的基础上,以体外合成的标准miRNA-21为检测对象,发现这种具有双重信号放大功能的分子信标检测技术检测下限可以达到1p M,其灵敏度比纯粹的分子信标检测法高3个数量级。进一步用于胃癌组织样品检测结果表明:该方法可用于准确检测0.2μg总RNA中的miRNA-21表达水平。3.基于分子信标实时监测UDG酶活性方法的建立及其应用本章以含有损伤碱基尿嘧啶的嵌合型分子信标作为酶促底物和信号报告分子,建立一种UDG酶的分析方法。通过实时荧光的方法来进行UDG酶的活性分析和对UDG酶的热动力学进行考察。结果表明UDG的检测下限可以达到0.005 U/ml,UDG酶的KM和kcat值分别为0.89±0.1μM和210±10 min-1。接着将其用于UDG酶抑制剂的筛选,发现5-氟尿嘧啶和顺铂具有显著UDG酶活性的功能,其IC50分别为6.1±0.52 m M和3.2±0.24 m M。最后将该方法用于不同肝癌细胞系和血清样本中的UDG酶表达水平差异分析。
【关键词】：分子信标 miRNA-21 UDG 肝癌 胃癌
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 绪论12-26
• 1.1 分子信标的结构及原理12-13
• 1.2 新型分子信标的种类13-17
• 1.3 分子信标技术的研究现状及应用17-21
• 1.3.1 分子信标技术在miRNA检测中的应用17-18
• 1.3.2 分子信标技术在蛋白质检测与分析中的应用18-19
• 1.3.3 分子信标技术在酶活性分析中的应用19-21
• 1.4 miRNA检测技术的研究现状及应用21-24
• 1.4.1 miRNA传统的检测方法21
• 1.4.2 基于酶促信号放大检测miRNA21-22
• 1.4.3 基于金纳米材料检测miRNA22-23
• 1.4.4 基于氧化石墨烯检测miRNA23-24
• 1.5 本文的选题背景和研究意义24
• 1.6 本文拟开展的工作24-26
• 第2章 分子信标用于肿瘤相关的miRNA-21的检测26-43
• 2.1 前言26
• 2.2 实验部分26-34
• 2.2.1 分子信标检测miRNA的实验原理26-27
• 2.2.2 试剂与仪器27-28
• 2.2.3 实验方法28-34
• 2.3 结果与讨论34-42
• 2.3.1 分子信标热变性曲线的建立34
• 2.3.2 温度和Mg~(2+)对分子信标稳定性的影响34-35
• 2.3.3 pH值和Mg~(2+)对分子信标杂交性能的影响35-36
• 2.3.4 分子信标信背比的考察36
• 2.3.5 分子信标特异性的考察36-37
• 2.3.6 分子信标杂交标准曲线的建立37-38
• 2.3.7 细胞总RNA的提取与鉴定38
• 2.3.8 荧光法检测肝癌细胞中miRNA-2138-39
• 2.3.9 RT-RCR方法检测肝癌细胞中miRNA-2139-41
• 2.3.10 荧光法检测胃癌组织中miRNA-2141
• 2.3.11 RT-PCR方法检测胃癌组织中miRNA-2141-42
• 2.3.12 miRNA-21调控的靶蛋白的检测42
• 2.4 本章小结42-43
• 第3章 基于分子信标结合酶促信号放大用于miRNA-21的超灵敏检测43-56
• 3.1 前言43-44
• 3.2 实验部分44-48
• 3.2.0 酶促信号放大检测miRNA原理44
• 3.2.1 仪器和试剂44-45
• 3.2.2 实验方法45-48
• 3.3 结果与讨论48-54
• 3.3.1 胃癌组织样品的统计与鉴定48-49
• 3.3.2 分子信标热变性曲线的建立49
• 3.3.3 分子信标信背比的考察49-50
• 3.3.4 分子信标抗酶切能力的考察50-51
• 3.3.5 分子信标杂交缓冲液条件的优化51-52
• 3.3.6 标准样品检测下限的确定52
• 3.3.7 DSN酶浓度条件的优化52-53
• 3.3.8 信号放大检测下限的确定53
• 3.3.9 胃癌组织样品的检测53-54
• 3.3.10 RT-PCR实验结果的验证54
• 3.4 本章小结54-56
• 第4章 基于分子信标实时监测UDG酶活性方法的建立及其应用56-66
• 4.1 前言56-57
• 4.2 实验部分57-59
• 4.2.1 实验设计原理57
• 4.2.2 试剂与仪器57-58
• 4.2.3 实验方法58-59
• 4.3 结果与讨论59-65
• 4.3.1 UDG酶对分子信标的影响59-60
• 4.3.2 分子信标信背比的考察60
• 4.3.3 Mg~(2+)浓度对UDG酶活性的影响60-61
• 4.3.4 温度对UDG酶活性的影响61
• 4.3.5 不同UDG酶浓度对反应初速度的影响61-62
• 4.3.6 UDG酶动力学的研究62
• 4.3.7 金属离子对UDG酶活性的影响62-63
• 4.3.8 UDG酶抑制剂的选择63
• 4.3.9 EDTA对复杂样品体系中UDG酶的影响63-64
• 4.3.10 细胞样品和血清样品UDG酶含量的测定64-65
• 4.4 本章小结65-66
• 结论与展望66-67
• 参考文献67-75
• 附录 攻读硕士学位期间参与发表论文和专利75-76
• 致谢76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 汤佳音;房静远;;非编码RNA在胃癌诊治中的研究进展[J];肿瘤;2014年06期

2 何文蕾;杨文杰;李媛媛;徐顺清;;基于银染增强的纳米金探针定量检测microRNA[J];生物化学与生物物理进展;2008年11期

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本文编号：746919