转录因子FOXA1调控乳腺癌上皮间质转化机制以及互作蛋白的研究

发布时间：2017-08-28 05:19

  本文关键词：转录因子FOXA1调控乳腺癌上皮间质转化机制以及互作蛋白的研究

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【摘要】：乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤之一,其全球发病率自上世纪70年代开始一直呈现上升趋势。乳腺癌细胞由于具有无限增殖、迁移性和侵袭性等特点,如果在乳腺癌发展后期才被检查出,往往很难治愈。因此深入探究乳腺癌细胞的各类信号通路以及寻找其中的靶基因十分重要。转录因子FOXA1属于叉头框FOX转录因子家族成员之一,与细胞的增殖、分化、胚胎成长、器官发育、肿瘤的发生发展等生理过程息息相关。大量研究结果表明,在肿瘤细胞中,FOXA1的表达情况与肿瘤分子分型和恶性程度高度关联。我们猜测FOXAl能调控细胞EMT相关基因的表达,可能是关键调控因子之一。本文主要研究FOXA1在乳腺癌细胞中的调控机制和互作蛋白的初步筛选鉴定。首先我们从临床样本出发,检测了实验室有的几十种临床样本的FOXA1、E钙粘素、波形蛋白的蛋白表达水平,发现在临床样本中FOXA1与上皮类型标志物E钙粘素的蛋白表达呈正相关,与间质类型标志物波形蛋白表达呈负相关。随后检测了实验室不同类型乳腺癌细胞中的FOXA1、E钙粘素、波形蛋白的蛋白和mRNA表达水平,发现在乳腺癌细胞中FOXA1表达高的细胞类型E钙粘素表达量也高,但波形蛋白表达水平低,由此我们得出在乳腺癌细胞中转录因子FOXA1与上皮表型相关的结论。ZEB2可以直接抑制E钙粘素的表达,我们推钡FOXA1可能参与调控ZEB2的转录。根据细胞FOXA1表达水平的不同,我们选用乳腺癌E型细胞MCF-7和三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468作为细胞模型,在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468中脂质体转染高表达FOXA1,发现ZEB2表达下降,上皮型标志物E钙粘素表达上升而间质型标志物波形蛋白表达下降。随后通过荧光素酶报告基因实验进行证实,发现FOXA1能够调控靶基因ZEB2的启动子并抑制其转录。为了寻找FOXA1的互作蛋白,更加深入的探究其在乳腺癌细胞信号通路中的功能,我们建立了His标签pull-down技术联合质谱分析的技术方法。首先我们构建了真核表达载体pcDNA3.1-His-FOXA1,在HEK293T细胞内瞬时转染高表达His-FOXA1蛋白,通过His标签pull down技术分离出FOXA1蛋白复合物,跑胶酶解后质谱分析鉴定样品中与转录因子FOXA1相互作用的蛋白质。通过数据库分析我们筛选出了8个可能与FOXA1互作的蛋白。这些研究为进一步研究FOXA1在乳腺癌细胞信号网络中的互作关系及调控功能奠定了前期基础。
【关键词】：乳腺癌 转录因子FOXA1 ZEB2 EMT 蛋白互作
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-13
• 第1章 绪论13-21
• 1.1 癌症13
• 1.2 乳腺癌与乳腺癌分型13-14
• 1.2.1 乳腺癌分型13
• 1.2.2 三阴性乳腺癌13-14
• 1.3 上皮间质转化——EMT过程14-15
• 1.3.1 EMT标志物15
• 1.3.2 转录因子ZEB2概述15
• 1.4 转录因子FOXA1概述15-17
• 1.4.1 FOXA1基因和蛋白结构16
• 1.4.2 FOXA1的生物学功能16-17
• 1.5 蛋白互作研究方法介绍17-19
• 1.5.1 酵母双杂交17-18
• 1.5.2 等离子共振18
• 1.5.3 免疫共沉淀18
• 1.5.4 噬茵体展示18-19
• 1.5.5 抗体与蛋白质阵列19
• 1.5.6 荧光能量转移19
• 1.6 本文研究背景及方法19-21
• 第2章 FOXA1的表达与乳腺癌上皮表型相关21-32
• 2.1 前言21
• 2.2 实验材料及实验仪器21-23
• 2.2.1 临床样本和乳腺癌细胞21
• 2.2.2 其它实验材料和仪器21-23
• 2.3 实验方法23-29
• 2.3.1 乳腺癌临床样本23
• 2.3.2 细胞培养23-25
• 2.3.3 RNA提取及逆转录25-26
• 2.3.4 荧光定量PCR26
• 2.3.5 Western Blotting26-29
• 2.4 实验结果与讨论29-31
• 2.4.1 乳腺癌临床样本中FOXA1与上皮特性相关29-30
• 2.4.2 乳腺癌细胞中FOXA1蛋白表达检测30-31
• 2.4.3 乳腺癌细胞中FOXA1、E-cadherin、vimentin mRNA表达水平检测31
• 2.4.4 讨论31
• 2.5 本章小结31-32
• 第3章 FOXA1调控下游靶基因ZEB232-41
• 3.1 前言32
• 3.2 实验材料及实验仪器32-34
• 3.2.1 细胞32
• 3.2.2 实验材料与仪器32-34
• 3.3 实验方法34-36
• 3.3.1 细胞培养34
• 3.3.2 质粒大提34-35
• 3.3.3 脂质体转染35
• 3.3.4 RNA的提取以及逆转录35
• 3.3.5 荧光定量PCR35-36
• 3.3.6 荧光素酶报告基因实验36
• 3.3.7 Western Blotting36
• 3.4 实验结果及讨论36-39
• 3.4.1 在乳腺癌临床样本中FOXA1与ZEB2表达呈负相关36-37
• 3.4.2 微镜下观察MCF-7、MDA-MB-468细胞形态37
• 3.4.3 在MCF-7、MB468细胞中检测内源性FOXA1、ZEB2以及E-cadherin、vimentin的mRNA表达情况37-38
• 3.4.4 高表达FOXA1后,MB-468细胞中ZEB2和上皮间质相关基因的mRNA和蛋白表达水平的检测38-39
• 3.4.5 FOXA1可以抑制ZEB2基因转录39
• 3.4.6 讨论39
• 3.5 本章小结39-41
• 第4章 运用His标签Pull-down技术对FOXA1互作蛋白的初步研究41-53
• 4.1 前言41
• 4.2 实验材料及实验仪器41-43
• 4.3 实验方法43-48
• 4.3.1 细胞培养43
• 4.3.2 磷酸钙转染43-44
• 4.3.3 细胞总蛋白提取44
• 4.3.4 PCR扩增人FOXA1基因44
• 4.3.5 基因与质粒的酶切、纯化、连接及转化44-46
• 4.3.6 质粒小提46
• 4.3.7 His标签pull-down技术46-47
• 4.3.8 SDS-PAGE电泳凝胶染色与Western印迹鉴定47
• 4.3.9 蛋白质酶解47-48
• 4.3.10 LTQ质谱检测48
• 4.3.11 数据分析48
• 4.4 实验结果与讨论48-52
• 4.4.1 pcDNA-His-FOXA1真核重组表达载体的构建及鉴定48-49
• 4.4.2 His标签pull-down技术流程的建立49-50
• 4.4.3 Western印迹鉴定pull-down产物50
• 4.4.4 Pull-down产物的SDS-PAGE分析50-51
• 4.4.5 质谱分析51
• 4.4.6 讨论51-52
• 4.5 本章小结52-53
• 结论53-54
• 参考文献54-59
• 附录A 英文缩写59-60
• 附录B 常用缓冲液和试剂配方60-62
• 附录C 攻读学位期间所发表的学术论文62-63
• 致谢63

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本文编号：747206