miR-21-3p在结直肠癌中作用的研究

发布时间：2017-08-30 01:15

  本文关键词：miR-21-3p在结直肠癌中作用的研究

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【摘要】：研究背景和目的结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,近年来在我国,随着人们生活水平的提高,饮食习惯与结构的改变,结直肠癌发病率和死亡率均呈明显上升的趋势。其发病率随年龄而增长,从40岁开始上升,60-75岁达到峰值,且具有年轻化,家族聚集,遗传易感等特征。由于癌瘤生长速度缓慢,在其达到产生症状、体征之前要经过相当长的时间。因此结直肠癌发病隐匿,待患者出现症状入院治疗时已出现转移,这是影响疗效和造成患者死亡的主要原因,也是结直肠癌术后复发的直接原因。目前对结直肠癌的治疗以手术为主,辅以放化疗,但疗效欠佳。因此探索结直肠癌发生、发展机制并寻找相关的治疗靶点具有重要的意义。MiR-21-3p是众多microRNA的一种,它是pre-miR21在细胞浆中由Dicer加工后,生成的成熟micro RNA。和其配对的miR-21-5p丰度高,变化稳定,在肿瘤中的功能和机制的研究已经日趋完善。所有的研究成果表明:miR-21-5p是在肿瘤中上调的micro RNA分子,且在不同组织肿瘤中的作用是一致的。那么miR-21-3p是否和癌基因mi R-21-5p在肿瘤中的作用相同?研究发现,miR-21-3p在三阴性乳腺癌、喉癌、肾脏、卵巢及子宫内膜癌等多种肿瘤中表达升高,由此可知,miR-21-3p在肿瘤的发生、发展中起着一定的调控作用,但机制并不明确。此外,miR-21-3p在结直肠癌中的作用没有任何报道,有待进一步的探索和研究。研究方法1.miR-21-3p在结直肠癌组织及细胞中的表达懫用荧光定量RT-PCR的方法在33对结直肠癌标本组织及与其配对的癌旁组织中检测miR-21-3p的表达,结合相应的病理组织信息,分析miR-21-3p的表达特点。检测在本实验室所有的11种结直肠癌细胞DLD-1、HCT-8、Caco-2、HCE-8693、RKO、SW480、SW620、HT29、LoVo、HCT116、LS174T中mi R-21-3p的表达,根据各个细胞中miR-21-3p的表达情况和细胞背景,选取合适的细胞进行实验。2.mir-21-3p对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影晌(1)订购慢病毒对照空表达载体lv3和过表达载体lv3-mir-21-3p,用其感染选定的hct116、sw480细胞,在显微镜下观察确定存在发绿色荧光的细胞后,用嘌呤霉素筛选含有慢病毒过表达载体的细胞株,持续两周以上,通过rt-pcr鉴定mir-21-3p是否在选定的细胞株中过表达,之后利用cck8和划痕实验、transwell迁移、侵袭实验,检测mir-21-3p在体外对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;(2)将mircornamimicscontrol和mir-21-3pmimics分别瞬时转染至上述实验使用的两株细胞中,利用westernblot和细胞荧光实验,检测mir-21-3p对emt(epithelial-mesenchymaltransition)指标的影响;(3)使用裸鼠作为整体可视化动物模型,对小鼠行皮下成瘤实验,测量最终成瘤体积和重量,观察mir-21-3p对裸鼠皮下成瘤能力的影响,同时利用得到的皮下瘤进行免疫组化实验,检测mir-21-3p对emt指标的影响;通过尾静脉注射,构建小鼠肺转移癌模型,通过观察小鼠的肺部组织中转移瘤的情况,进一步说明mir-21-3p对癌细胞转移能力的影响。3.统计学分析采用spss17.0统计软件进行数据分析。组织和细胞的荧光定量pcr结果均比较2-△ct,不同之处在于组织采用配对样本t检验,细胞懫用独立样本t检验(independent-samplesttest)。transwell迁移实验、侵袭实验,划痕实验检测结果均采用独立样本t检验。p0.05为差异有统计学意义。研究结果1.mir-21-3p在结直肠癌组织及细胞中的表达荧光定量rt-pcr检测结果显示:在27对新鲜结直肠癌配对组织中,mir-21-3p在结直肠癌组织中的表达明显高于正常粘膜组织,表达差异有统计学意义(t=-5.365,p=0.000)。mir-21-3p在rko细胞中的表达高于其他10种细胞。2.mir-21-3p对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响(1)用嘌呤霉素筛选构建的hct116和sw480过表达稳定株,rt-pcr结果表明:和lv3-nc组相比,含有lv3-mir-21-3p的hct116、sw480细胞中,miR-21-3p的表达水平上升,差异具有统计学意义(t=-15.019,p=0.000;t=-83.302,p=0.000)。(2)CCK8法对细胞体外增殖能力的改变进行检测结果显示:与LV3-NC组相比,LV3-miR-21-3p细胞增殖能力基本无变化,差异不具有统计学意义,说明miR-21-3p对于细胞的增殖能力没有影响。(3)Transwell实验和划痕实验表明:与LV3-NC组相比,稳定过表达mi R-21-3p的HCT116、SW480细胞的迁移能力增强,同时差异具有统计学意义(t=-32.986,p=0.000;t=-11.620,p=0.000),该结果在迁移实验和划痕实验中表现一致;小室侵袭实验表明:与LV3-NC组相比,稳定过表达miR-21-3p的HCT116、SW480细胞的侵袭能力增强,差异具有统计学意义(t=-9.257,p=0.000;t=-8.552,p=0.000)。(4)将mi R-21-3p mimics分别转染结直肠癌细胞HCT116和SW480,RT-PCR结果表明:和mimics control组相比,转染mimics后的HCT116、SW480细胞中,miR-21-3p的表达水平上升,差异具有统计学意义(t=-26.508,p=0.000;t=-60.562,p=0.000);在此基础上,Western Blot和细胞荧光结果一致表明:转染mimics后,结直肠癌细胞HCT116和SW480的EMT能力增强。(5)裸鼠皮下成瘤实验表明:与LV3-NC组相比,稳定过表达miR-21-3p的HCT116、SW480细胞所形成肿瘤的大小和重量相差无几,并没有统计学意义。皮下瘤免疫组化实验显示:稳定过表达miR-21-3p后,结直肠癌细胞HCT116和SW480的EMT能力增强。裸鼠肺转移癌说明:和LV3-NC相比,过表达miR-21-3p后,结直肠癌更易转移,更易形成肺部肿瘤。结论1.MiR-21-3p在结直肠癌组织中的表达量远远高于癌旁组织;2.MiR-21-3p提升结直肠癌细胞侵袭和转移能力,其靶基因的鉴定将在后续实验中展开;
【关键词】：microRNA 结直肠癌 迁移 侵袭
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 前言12-16
• 第一章 结直肠癌中miR213p的表达特性的鉴定16-24
• 一、材料与方法16-19
• 二、结果19-21
• 三、讨论21-24
• 第二章 miR213p对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响24-47
• 第一节 miR213p对结直肠癌细胞体外生物学特性的影响24-37
• 一、材料与方法24-29
• 二、结果29-37
• 第二节 miR213p对结直肠癌细胞体内生物学特性的影响37-47
• 一、材料与方法37-40
• 二、结果40-44
• 三、讨论44-47
• 第三章 miR213p靶基因的筛选与鉴定47-52
• 一、材料与方法47-49
• 二、结果49-51
• 三、讨论51-52
• 综述 MiR213p在常见肿瘤中的研究进展52-56
• 中英文缩略词56-57
• 参考文献57-60
• 致谢60-62

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本文编号：756459