靶向舌鳞癌细胞高分子超声造影剂的制备及体外寻靶实验

发布时间：2017-08-30 02:23

  本文关键词：靶向舌鳞癌细胞高分子超声造影剂的制备及体外寻靶实验

  更多相关文章： 聚乳酸/羟基乙酸共聚物 超声微泡 靶向舌鳞癌细胞 分子成像

【摘要】：舌鳞状细胞癌(Tongue squamous cell carcinoma, TSCC)患者早期易发生颈部淋巴结转移,明显影响其预后,并决定肿瘤分期及治疗方案。于是及时诊断及治疗舌癌患者颈部转移淋巴结成为提高生存率的迫切需求。基于临床上尚无一种可靠客观的无创性检查和治疗手段。第4代声学造影剂由于具备有靶向诊断和靶向给药的功能成为诊疗舌癌原发灶及其颈部淋巴道转移灶的探索方向。其中,高分子聚合物作为第4代超声造影剂(Ultrasound contrast agent, UC A)外壳材料之一,聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(Lactic-co-glycolic acid), PLGA]具备优异的生物相容性、可控生物降解性、良好的成球或成膜性能以及增加药物和DNA投递和定位的功效优势。TATp(transactivating transcriptional activator protein from human immunodeficiency virus type 1, HIV-1 TAT)人类免疫缺陷病毒的反式转录活化因子作为细胞穿膜肽之一,能将载药超声微泡(Ultrasound microbubble, UM)迅速、高效和安全的带入并滞留在细胞内部。但TATp缺乏细胞特异性。趋化因子SDF-1 (stromal cell-deried factor 1)又名为CXCL12,其唯一能与之结合并激活的受体为CXCR4,远高表达于出现转移淋巴结(Metastatic lymph node, MLN)的舌鳞癌细胞膜上,在不同口腔鳞癌细胞中阳性表达率高达72.3%～89.6%。而凋亡素蛋白(apoptin或VP3)由鸡贫血病毒(Chicken anemia virus, CAV)基因编码,具有肿瘤细胞特异性。对正常细胞无毒性,也同时具有一定靶向性。采用乳化溶剂挥发法(WI/O/W2)制备出靶向载药PLGA的UM,由于受到制备配方中多步骤的限制,仍然存在载药量(Drug loading,DL)较低问题,于是优化制备工艺成为必须。综上,本课题主要旨在制备一种TATp与SDF-1修饰的新型载VP3基因靶向高分子UM,并优化制备工艺,提高载药量。通过体外寻找舌scc-15细胞,验证所制得的UCA靶向性,从而为舌癌原发灶及其颈部淋巴道转移组织的无创早期诊断和非手术治疗提供一种新思路和新手段。本实验分以下两部分：第一部分靶向舌鳞癌细胞载基因超声微泡的制备及其优化目的：1.制备一种载VP3基因,并TATp与SDF-1同时修饰新型载基因高分子靶向UCA。并探讨制备因素对其粒径、载药量、包封率等.影响,从而筛选出制备UM的最佳组合。2.评价该靶向UCA基本特性、对DNA保护性、体外释放效果、分子成像效果以及TATp、SDF-1在高分子UM表面连接状况。方法：1.采用WI/O/W2法及真空冷冻干燥法制备载VP3基因PLGA的UM,并使用单因素和正交分析实验优化其制备条件,提高载药量。并通过硫醚键将SDF-1与TATp同时共价联接到微泡表面,制备出靶向舌鳞癌细胞载VP3基因PLGA的UM(TATp-SDF-1-VP3-PLGA-UM,TSVP-UM)。2.普通光学显微镜观察该UM形态以及分散性；Nano-Drop紫外分光光度计评估其载药量及包封率；透射电镜观察其内部结构；Malvern测量仪测定其粒径以及分布、表面电位；流式细胞仪(Flow cytometry, FC)及激光扫描共聚焦荧光显微镜(Laser scanning confocal microscopy, LSCM)检测TATp、 SDF-1在高分子UM表面连接状况；酶切反应实验鉴定其对DNA保护性；Nano-Drop紫外分光光度计检测其体外释药性能；彩色多普勒超声成像诊断仪评价其体外成像效果。结果：1.使用单因素和正价分析所得最佳制备方案为VP3基因/PLGA质量比为1.6%,VP3基因浓度为8ug/ul,水相／油相体积比(W1/O)为1：15。2.靶向载基因UM呈规则球形,分散性好。粒径分布集中,大小以490.2-522.6nm之间为主,表面电位为-17-0mv。平均载药量为0.86%,平均包封率为40.47%。对DNA保护作用持续60min,未见损坏。长达24天缓慢持久释放VP3基因。单独TATp、SDF-1与PLGA微泡表面连接率分别为98.37%、97.07%。同时加载TATp、SDF-1于PLGA微泡表面的连接率,TATp为69,84%、SDF-1为71.08%。体外超声成像效果较好。结论：通过优化制备工艺及化学硫醚键联接成功制备出TSVP-UM。该UM粒径满足静脉给药需求,并具有载药量较高、长效缓释、体外成像效果较好的特性,兼具诊断和治疗的理想载药超声造影剂系统的基本性能。第二部分靶向舌鳞癌细胞载基因超声微泡制备及体外寻靶实验实验研究目的：按照优化方案制备TSVP-UM。并初步探讨其体外寻靶性能。方法：1.体外培养SCC-15细胞,接种6孔板,制备细胞爬片。2.按优化参数制备靶向组TSVP-UM,以及非靶向组载VP3基因高分子超声微泡(VP3-PEG-PLGA-UM, VPP-UM)。与细胞爬片共孵育30min～1h。3.光镜下比较观察两组UM与SCC-15细胞结合情况,流式细胞仪量化两者结合律。结果：1.光镜观察显示,靶向微泡组TSVP-UM簇聚化SCC-15细胞膜区域,少量已穿过细胞膜进入到胞质内部。而非靶向组VPP-UM较少粘附与细胞膜上。2.流式细胞仪半定量结果表明,靶向组联接率为91.44%,非靶向组为12.96%。结论：体外寻靶验证了TSVP-UM对SCC-15细胞具备较强靶向性。并且同时发现在较短时间内,TSVP-UM已少许穿膜进入到SCC-15细胞内部。初步验证了TSVP-UM壳层联接的TATp的生物活性。TSVP-UM作为一种非病毒基因载体有望成为一类作用于舌SCC及其淋巴道转移组织、安全有效的基因传递系统。
【关键词】：聚乳酸/羟基乙酸共聚物 超声微泡 靶向舌鳞癌细胞 分子成像
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.8
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-19
• 第一部分 靶向舌鳞癌细胞载基因超声微泡的优化制备及评估19-40
• 第一节 靶向舌鳞癌细胞载VP_3基因高分子超声微泡的制备及特性检测19-28
• 1 材料与方法19-23
• 2 结果23-28
• 第二节 靶向舌鳞癌细胞载VP_3基因高分子超声微泡制备优化及特性检测28-40
• 1 材料与方法28-33
• 2 结果33-38
• 3 讨论38-40
• 第二部分 TATp和CXCR4修饰的载VP3基因超声微泡体外导靶实验研究40-47
• 1 材料与方法40-45
• 2 结果45-46
• 3 讨论46-47
• 全文总结47-49
• 参考文献49-55
• 附图55-56
• 文献综述56-65
• 参考文献62-65
• 致谢65-66
• 攻读硕士期间发表的论文66

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 严文洪,唐峰,张孟殷;舌鳞癌微血管密度的研究[J];上海医学;2001年09期

2 朱永学,黄彩萍,吴毅;早期舌鳞癌的隐匿性淋巴结转移与治疗[J];中国癌症杂志;2001年02期

3 曾曙光,陈伟良;一氧化氮在舌鳞癌血管生成中的作用[J];中山医科大学学报;2002年05期

4 李秋梨,陈福进,曾宗渊,杨安奎,吴秋良,张惠忠,伍国号,许光普,郭朱明,张诠;舌鳞癌隐匿性颈淋巴结转移与临床病理相关因素的关系[J];癌症;2003年01期

5 杨亦萍,卿海云,曹阳;舌鳞癌预后与细胞增殖和凋亡的关系[J];中华口腔医学杂志;2003年01期

6 曾曙光,艾伟健,陈伟良;血管内皮生长因子表达及微血管密度在舌鳞癌侵袭性生长中的意义[J];广东牙病防治;2004年01期

7 阮敏,王元银,陈乔尔,王银龙,何家才,周健;舌鳞癌环氧化酶-2的表达及临床意义[J];安徽医科大学学报;2004年05期

8 万宏坤;舌鳞癌颈部淋巴结转移的临床分析[J];河南肿瘤学杂志;2004年06期

9 姚金光,邝晓聪,温冠媚,李俊;基质金属蛋白酶-9表达与舌鳞癌浸润转移的关系[J];右江医学;2005年05期

10 郝凤翔;武云霞;;人舌鳞癌裸鼠移植瘤模型的建立[J];山西医科大学学报;2008年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 叶华山;潘朝斌;黄洪章;李劲松;赵小朋;张彬;王建广;杨朝晖;;127例舌鳞癌患者单纯手术治疗的生存和预后分析[A];第八次全国口腔颌面—头颈肿瘤会议论文汇编[C];2009年

2 余东升;黄洪章;潘朝斌;刘习强;唐海阔;胡晓文;;放射诱导启动子介导双自杀基因治疗人舌鳞癌裸鼠移植瘤的实验研究[A];第五次全国口腔颌面—头颈肿瘤学术研讨会论文汇编[C];2006年

3 周何强;徐华;魏运辉;乐飞;;212例舌鳞癌的手术及综合治疗的疗效分析[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年

4 王帆;王学庆;刘良福;李尊民;;舌鳞癌术前超选择舌动脉灌注化疗栓塞的临床应用[A];第八届全国肿瘤介入诊疗学术大会、第一届中国抗癌协会肿瘤介入学护理专业学组会议暨国家级介入诊疗继续教育学习班、肿瘤介入治疗新进展研讨会论文汇编[C];2007年

5 刘天润;杨安奎;陈福进;李秋梨;曾宗渊;陈艳峰;欧阳电;郭朱明;张诠;;229例晚期舌鳞癌患者的生存和预后分析[A];中华医学会第十次全国耳鼻咽喉-头颈外科学术会议论文汇编（上）[C];2007年

6 潘朝斌;黄洪章;陈伟良;王建广;李海刚;;肿瘤血管生成与舌鳞癌预后的相关性研究[A];第一届全国口腔颌面部肿瘤学术会议论文汇编[C];2001年

7 卢利;王玉新;王兆元;;舌鳞癌淋巴细胞浸润的观察[A];中华口腔医学会第二次全国会员代表大会暨第七次全国口腔医学学术会议论文汇编[C];2001年

8 曾宗渊;彭汉伟;陈福进;郭朱明;张诠;魏茂文;杨安奎;陈文宽;;舌鳞癌颈淋巴结治疗模式的探讨[A];第三届中国肿瘤学术大会教育论文集[C];2004年

9 姚华;吴求亮;姚晨;范骏;;反义端粒酶逆转录酶基因寡核苷酸对人舌鳞癌细胞凋亡的影响[A];浙江省第二十次肿瘤防治学术年会暨首届浙江肿瘤学术周论文汇编[C];2006年

10 王雷;陈英新;;乳铁蛋白对舌鳞癌细胞血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子表达影响的实验研究[A];第七届全国口腔黏膜病暨第五届口腔中西医结合大会论文汇编[C];2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 向旭;舌鳞癌连续整块切除术预后及其影响因素的临床研究[D];中南大学;2010年

2 徐文华;白细胞介素-8在舌鳞癌中的表达及其与血管新生的相关性研究[D];安徽医科大学;2006年

3 贾搏;舌鳞癌患者长链非编码RNA分子鉴定及其表达谱分析研究[D];南方医科大学;2014年

4 俞小玲;异硫氰酸苄基酯对人舌鳞癌细胞生长的影响[D];浙江大学;2011年

5 刘志刚;血管抑素下调人舌鳞癌细胞血管内皮生长因子的表达[D];重庆医科大学;2008年

6 蒋文;蛋白激酶C-δ在舌鳞癌中的表达特征及热诱导舌鳞癌细胞凋亡中的作用[D];昆明医学院;2009年

7 刘凯;不同温度和时间对人舌鳞癌细胞凋亡影响的研究[D];佳木斯大学;2009年

8 李学敏;裸鼠人舌鳞癌颈淋巴结转移模型癌灶及癌周淋巴管生成密度的观察研究[D];天津医科大学;2013年

9 刘亚莉;雌激素受体在人舌鳞状细胞癌细胞中的表达及β-雌二醇对人舌鳞癌细胞增殖的影响[D];第四军医大学;2002年

10 董刚;异搏定增强长春新碱抗人舌鳞癌细胞作用的体外研究[D];南昌大学;2006年

，

本文编号：756745