糖基化聚氨基葡糖增强光动力治疗免疫效应的初步探讨

发布时间：2017-09-01 07:45

  本文关键词：糖基化聚氨基葡糖增强光动力治疗免疫效应的初步探讨

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【摘要】：研究背景近年来,恶性肿瘤的发病率呈现逐步上升的趋势,严重威胁人类健康。各项数据表明,癌症俨然成为人类的第一杀手,控制癌症成为世界各国政府的卫生战略重点,癌症的综合治疗成为世界所关注的研究课题。在恶性肿瘤的诸多治疗方法中,光动力治疗(Photodynamic Therapy,PDT)是一种有着良好应用前景的研究新领域。自PDT问世以来,以其安全、有效、副作用小、可重复性、相对成本低和可协同性等优点在肿瘤的治疗中显示出很强的生命力。PDT在临床应用中取得令人瞩目的成就,对于部分癌前病变、早期恶性肿瘤病例能够达到治愈的目的,并且为中晚期癌症患者,特别是拒绝(或无法)采用传统治疗方法者提供了一种新的治疗选择。目前很多国家开展了肿瘤PDT的研究,并使众多癌症患者受惠于这一治疗方法。它的应用不仅在于体表肿瘤,对呼吸道、胃肠道、颅内、眼、膀胱等部位的肿瘤也取得了良好的治疗效果。光动力治疗是利用光敏剂在不同组织中半衰期不同,在一定时间内形成光敏剂选择性滞留于肿瘤组织内,在此时间段内通过特定波长的激光照射肿瘤局部,以激活光敏剂,使其与肿瘤组织内的氧分子发生光化学作用,产生化学性质活泼的单态氧(1O2)及其他活性氧物质(radical oxygen species, ROS),导致细胞内蛋白质、核酸和脂类等生物大分子发生氧化损伤,从而起到如下作用：1.直接的细胞杀伤效应；2.引起肿瘤组织中微血管的破坏,造成局部缺血缺氧导致细胞死亡；3.局部的氧化应激反应激活补体系统、促使多种炎症及免疫因子的产生和释放,诱导各种炎性细胞、免疫细胞快速浸润至肿瘤局部,最后形成全身性的抗肿瘤免疫反应。它包含了3个不可或缺的成分：1.系统或局部应用的光敏剂：2.与光敏剂最大吸收波长相适应的近红外激光；3.能够在激发后变成单态氧(102)的分子氧。然而,PDT也有其自身的局限性,如现有光动力技术的杀伤深度有限,肿瘤消退后复发率高,对远处转移病灶治疗效果有限等。为了克服这些弊端,研究者们开始关注于PDT与免疫治疗的联合应用,试图通过提高肿瘤细胞的免疫原性或加强激活宿主自身免疫系统,以主动免疫应答的方式,激发机体抗肿瘤免疫,以期达到治疗肿瘤和预防肿瘤复发的目的。激光免疫疗法(laser immunotherapy, LIT)是1997年美国俄克拉何马州大学的Chen等适时提出的,其基本原理是通过光导纤维将特定波长的激光辐照于肿瘤组织局部,以激发选择性滞留在肿瘤组织中的光敏剂从而产生光化学、光物理效应,局部杀伤肿瘤细胞；同时瘤内注射免疫佐剂,受损的肿瘤细胞释放的肿瘤抗原能够与免疫佐剂结合形成特殊的肿瘤疫苗,激活机体特异性免疫系统,从而达到杀灭原发肿瘤及远处转移瘤的目的,并且产生免疫记忆。研究目的1.探讨经典光敏剂Photofrin介导的光动力疗法在体外对小鼠乳腺癌细胞EMT6的杀伤作用特点,以寻找糖基化聚氨基葡糖(glycated chitosan, GC)激光免疫疗法的理想作用参数。2.在小鼠EMT6乳腺癌模型上,观察激光免疫治疗三要素(光敏剂、激光、免疫佐剂)不同组合方式的治疗方法对小鼠EMT6肿瘤的抑制效应及对荷瘤小鼠生存的影响。治愈小鼠再次接种相同数量的EMT6细胞,观察是否有肿瘤形成及其生长情况,探讨激光免疫治疗的长期抗瘤效应。3.观察不同处理后EMT6肿瘤诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、热休克蛋白70(HSP70)、环氧化酶2(COX-2)、活化的凋亡蛋白3(Actived-Caspase3)表达的差异及CD3+T细胞、CD8+T细胞和表达细胞毒性标志颗粒酶B阳性淋巴细胞浸润差异,以比较各组氧化应激、凋亡水平和细胞免疫效应强度的差异。4.在小鼠4T1转移性乳腺癌模型上,比较激光免疫治疗和光动力治疗对远处转移瘤的预防和治疗作用,并比较各组荷瘤小鼠的脾系数,证实免疫系统的参与。研究方法和内容1.利用荧光显微镜下观察和多功能酶标仪检测荧光值的方法研究Photofrin在EMT6细胞中的吸收情况。通过MTT法检测PDT疗效三大影响因素(光敏剂浓度及孵育时间、功率密度、能量密度)对光动力细胞杀伤效应的影响。2.建立BALB/c小鼠臀部皮下EMT6乳腺癌模型,取瘤体合格小鼠分为6组(PDT+GC组、PDT组、Laser+GC组、Laser组、GC组、Control组),分别接受相应的激光免疫治疗三要素(光敏剂、激光、免疫佐剂)不同组合方式的治疗,隔天测量肿瘤体积并记录小鼠死亡时间,绘制肿瘤生长曲线和荷瘤小鼠的生存曲线,比较各组小鼠肿瘤生长情况及生存时间。其中局部瘤体及转移瘤消失小鼠继续观察,至治疗后90天仍存活且未出现复发者视为治愈小鼠。对治愈小鼠,再次接种与首次接种数目相同的EMT6肿瘤细胞,观察是否有肿瘤生长及其增长情况。3.于治疗后2天(48h)每组取3只小鼠,通过免疫组织化学和免疫印迹的方法,比较不同处理后肿瘤组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、热休克蛋白70(HSP70)、环氧化酶2(COX-2)、活化的凋亡蛋白3(Actived-Caspase3)表达的情况。治疗2周后每组取3只小鼠,通过免疫组织化学的方法,比较CD3+T细胞、CD8+T细胞和表达细胞毒性标志颗粒酶B阳性淋巴细胞的浸润水平。以比较各组氧化应激、细胞凋亡和细胞免疫效应强度的差异。4.建立BALB/c小鼠腹股沟皮下4T1乳腺癌模型,取瘤体合格小鼠分为3组(PDT+GC组、PDT组、Control组),分别接受相应的治疗。治疗1周后,每组处死小鼠3只,无菌取出肺脏,通过机械和酶消化的方法制备肺组织的单细胞悬液,加到含有6-巯鸟嘌呤的培养基中,利用4T1细胞对6-巯鸟嘌呤的选择性耐药特性进行平板克隆实验,14天后比较各组克隆形成情况。治疗3周后,处死各组小鼠3只,称量小鼠体重,取出肺脏,使用Bouin's溶液固定肺脏组织24小时后,计数肺脏表面白色瘤结节的个数并进行组间比较,通过HE染色验证转移瘤的形成。取出小鼠脾脏,测量脾脏重量,计算各小鼠的脾系数(脾脏重量÷小鼠自身体重)。研究结果1.倒置荧光显微镜下观察8μg/ml Photofrin与EMT6细胞孵育时间小于8h时,可见细胞发出微弱的红色荧光,细胞轮廓不清晰。8h-24h细胞轮廓较清楚,12h荧光最强,细胞形态未发生明显改变且继续增殖,说明8μg/ml Photofrin在24小时内细胞暗毒性低。多功能酶标仪检测荧光值,发现在一定范围内细胞内光敏剂含量随着光敏剂的浓度升高及孵育时间的延长而升高。2.在功率密度12.5mW/cm2、能量密度7.5J/cm2照射条件下,在一定范围内,随着光敏剂的浓度及孵育时间的延长,光动力治疗体外杀伤效应增强。8ug/ml Photofrin孵育6h抑制率可达到50%。在8μg/ml Photofrin孵育6h后、能量密度为7.5J/cm2照射条件下,功率密度在一定范围内对光动力治疗体外杀伤效应无明显影响(P=0.076),相同功率密度的单纯激光对细胞无明显毒性(P0.05)。在8μg/ml Photofrin孵育6h后、功率密度均为12.5mW/cm2照射条件下,在一定能量密度范围内,PDT杀伤效应随能量密度上升而增强(P0.01),相同能量密度的单纯激光对细胞无明显毒性(P0.05)。3.小鼠臀部皮下EMT6乳腺癌模型成瘤率100%,6组治疗前肿瘤体积无差异(P=0.594),治疗后观察PDT+GC组发现瘤体依次出现水肿、发黑、焦痂形成、焦痂脱落,瘤体缩小后轻微增大或消失。PDT组肿瘤在治疗后体积明显缩小,在第9天左右治疗焦痂掉落后可见残余肿瘤组织,之后又逐渐增大。PDT+GC组在治疗后第1天由于肿胀明显,肿瘤体积有所增大,但之后随着水肿的减轻,至治疗后第9天左右体积与PDT组相当,之后肿瘤生长缓慢,部分仍有缩小趋势。重复测量的方差分析显示PDT+GC组与PDT组肿瘤体积未见明显差异(P=0.282)。各组的生存分析显示PDT+GC组、PDT组、Laser+GC组小鼠的中位生存时间比Contro1组长(P值分别是0.000、0.001、0.003),且PDT+GC组与PDT组或Laser+GC组相比存在生存优势(P值分别为0.036、0.000)。治愈小鼠在再次接种相同数目的肿瘤细胞后,皮下肿块出现时间晚、肿瘤生长较同龄对照小鼠缓慢,且PDT+GC组两只小鼠肿瘤分别于接种后27d和35d完全消失。4.瘤组织HE染色见PDT+GC;组、PDT组出现明显的坏死带,血管内红细胞淤积、血栓形成,且坏死灶周围有明显的炎性细胞浸润,Laser+GC组、Laser组、GC组坏死较轻微。在治疗后的两周,PDT+GC组、PDT组和Laser+GC组的肿瘤组织内CD3+T细胞、CD8+T细胞和表达细胞毒性标志颗粒酶B阳性淋巴细胞的浸润数目比均较对照组高(P0.001),但是这3种标志的浸润数目比在GC组和对照组没有区别(P值分别是0.978、0.424、0.430)。Laser组CD8+T细胞和表达细胞毒性标志颗粒酶B阳性淋巴细胞的浸润数目比较对照组高(P值分别是0.001、0.025),但CD3+T细胞的浸润比在两组之间无差异(P=1.000)。虽然PDT+GC组与PDT组相比CD3+T细胞的浸润比无差异(P=0.712),但是免疫细胞具有杀伤活性的标志CD8和Granzyme B在PDT+GC组表达数目比较PDT组高(P值分别是0.030,0.022)。在治疗后48小时用免疫组化的方法检测各组肿瘤组织iNOS、HSP70、COX-2和Actived-Caspase3的表达情况,结果显示PDT+GC组、PDT组、Laser+GC肿瘤组织中iNOS、HSP70、COX-2和Actived-Caspase3的表达水平均较对照组高(P0.001)。虽然PDT+GC组和PDT组肿瘤组织COX-2的表达水平无明显差异(P=0.078),但PDT+GC组氧化反应标志iNOS、应激水平标志HSP70、细胞凋亡标志Actived-Caspase3的表达水平均较PDT组高(P值分别是0.038、0.039、0.040)。PDT+GC组4种蛋白的表达水平均较Laser+GC组高(P值分别是0.000、0.021、0.040、0.021)。这4种蛋白水平在GC组与对照组中无明显差异。5.免疫印迹的结果显示PDT+GC组与对照组相比Caspase-3表达下降,Actived-caspase-3、COX-2、HSP70表达升高。PDT+GC组与PDT组相比Actived-caspase-3表达较高,Caspase-3表达较低。6.小鼠腹股沟皮下4T1乳腺癌模型成瘤率100%,分组(PDT+GC组、PDT组、Control组)治疗1周后,药物筛选肺组织肿瘤细胞的平板克隆实验示PDT+GC治疗、PDT治疗后肺脏转移细胞数量显著小于Control组(P值分别是0.002、0.042),且PDT+GC组少于PDT组(P=0.035)；治疗后3周肺脏大体标本观察示PDT+GC组、PDT组肺脏表面肿瘤结节数量显著小于Control组(P值分别是0.001、0.017),且PDT+GC组少于PDT组(P=0.028)；HE染色验证肺脏转移瘤的形成；PDT+GC组与PDT组脾系数均大于Control组(P值分别是0.001、0.029),且PDT+GC组脾系数大于PDT组(P=0.031)。研究结论1.本研究客观观察了光敏剂的吸收过程。发现细胞吸收一定浓度的光敏剂和接受适当剂量的光照是光动力治疗体外杀伤效应的两个必备条件,找到更理想的光照剂量、光敏剂浓度、给药-治疗间隔时间是提高PDT疗效的关键。2.LIT治疗能够显著抑制肿瘤的生长,延长实验小鼠的生存时间,并且产生特异性抗肿瘤免疫。LIT治疗与单纯的PDT治疗相比能够增加局部NO产量、增加局部肿瘤细胞HSP70表达,增强局部炎症反应、促进肿瘤细胞凋亡、趋化更多的免疫活性细胞至肿瘤局部。3.GC能够增强PDT治疗的系统抗肿瘤效应,并证实这种系统抗肿瘤效应存在机体免疫系统的参与。4.4T1转移性乳腺癌模型是一种比较理想的激光免疫治疗模型。利用4T1细胞对6-巯鸟嘌呤选择性耐药特性,我们可以更加直观地观察到LIT治疗的系统效应,早期发现转移。
【关键词】：光动力治疗 激光免疫治疗 恶性肿瘤 糖基化聚氨基葡糖 4T1转移性乳腺癌模型 免疫效应
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-20
• 第一章 前言20-29
• 1.1 光动力治疗的基本原理、作用机制和优缺点21-23
• 1.2 激光免疫治疗的概念及意义23-25
• 1.3 相关蛋白与恶性肿瘤的关系25-28
• 1.4 小鼠4T1转移性乳腺癌模型的特点28-29
• 第二章 Photofrin-PDT对EMT6体外抑制效应研究29-40
• 2.1 材料与仪器29-30
• 2.2 实验方法30-34
• 2.3 结果34-38
• 2.4 讨论38-39
• 2.5 结论39-40
• 第三章 GC联合光动力治疗增强特异性抗肿瘤免疫的初步探讨40-72
• 3.1 材料与试剂40-42
• 3.2 实验方法42-52
• 3.3 结果52-68
• 3.4 讨论68-71
• 3.5 结论71-72
• 全文小结72-73
• 参考文献73-79
• 中英文对照缩略词表79-81
• 攻读学位期间成果81-82
• 致谢82-83

【共引文献】

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 赵洪友;通过调节线粒体形态提高光动力治疗肿瘤效果的基础研究[D];中国人民解放军医学院;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 文永兵;金丝桃素对实验性类风湿性关节炎滑膜细胞的光动力效应的研究[D];安徽中医药大学;2014年

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本文编号：770835