4EGI-1对人胶质瘤U251细胞体外生物学行为的影响

发布时间：2017-09-01 19:45

  本文关键词：4EGI-1对人胶质瘤U251细胞体外生物学行为的影响

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【摘要】：胶质瘤起源于神经胶质细胞,是最为常见的原发颅内肿瘤。根据WHO对于中枢神经系统肿瘤的分类胶质瘤被分为I-IV级,其中III-IV级胶质瘤属于恶性,占所有胶质瘤的77.5%。研究表明,恶性胶质瘤的年发病增长率在1.2%左右。恶性胶质瘤主要引起颅内压增高及神经功能障碍,严重威胁患者生命安全。针对恶性胶质瘤采取的主要治疗手段是以手术切除为主,根据病理检查结果结合放疗、化疗等措施的综合治疗。免疫治疗、基因治疗、分子靶向治疗等新的治疗方法也正在逐步被应用到恶性胶质瘤的治疗中。尽管影像、麻醉、定向、导航、监测、放化疗等技术设备以及药物的发展,恶性胶质瘤患者的预后仍不容乐观。数据显示,我国脑及CNS恶性肿瘤死亡率为2.91/10万,构成比为2.39%。因此,寻找有效的手段治疗恶性胶质瘤有着重要的临床价值,会带来良好的社会效益。真核生物中,翻译起始因子eIFs在mRNA的转录、翻译、蛋白质生物合成过程中起到了关键性作用,其中eIF4A、eIF4E、eIF4G共同组成eIF4F复合物,启动含有5’帽式结构的mRNA翻译过程。研究表明,eIF4F复合物能够调节多种与肿瘤密切相关的基因的异常表达,具体表现为促进增殖、抑制凋亡、诱发放化疗抵抗、加速瘤组织血管化等。eIF4E结合蛋白4E-BPs的磷酸化水平是决定eIF4F复合物能否组装成功的关键:低磷酸化的4E-BPs会结合eIF4E,阻止了eIF4G与eIF4E结合,造成eIF4F复合物组装困难;反之,高磷酸化的4E-BPs不结合eIF4E,eIF4G会更多的与eIF4E结合组装成eIF4F复合物,进而造成eIF4F复合物增加。线粒体在细胞内代谢、氧化还原平衡和细胞死亡的调控方面发挥了重要的作用。此外,线粒体应激反应升高和肿瘤的侵袭以及手术愈后有密切关系。当线粒体应激反应超过了细胞所能承受的范围将会触发细胞毒性反应,从而抑制肿瘤细胞的演进。包括:线粒体膜肿胀和膜上孔道打开,导致如细胞色素C等促细胞凋亡因子的外泄以及ATP合成和供给的下降。通过诱导线粒体功能异常作为肿瘤治疗的目标在近年来取得了越来越多的关注。若干因子被证实能够通过影响线粒体的功能,从而抑制肿瘤细胞在体内和体外的生物学行为。4EGI-1是一种小分子化合物,能够模拟4E-BPs的功能,扰乱eIF4G来源的肽链和eIF4E结合,进而形成稳固的eIF4E/4EGI-1复合物,阻断eIF4F复合物的形成。研究指出在多种肿瘤细胞系中,4EGI-1抑制了帽式翻译进而抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,这种以eIF4F复合物为靶点基因治疗恶性肿瘤的小分子化合物具有潜在的应用前景。然而4EGI-1对肿瘤细胞的增殖和凋亡的作用以及相关机制还没有被证实。因此,我们通过帽式翻译抑制因子4EGI-1处理U251细胞,通过Western blot观察其对eIF4F复合物的影响;通过TUNEL染色、流式细胞术观察U251细胞凋亡;通过MTS细胞活性测试检测细胞活力;通过Rh123染色检测线粒体MMP变化;通过DCFH荧光检测ROS的产生;通过LDH释放检测细胞毒性;通过克拉克型氧气电极检测细胞线粒体复合物-I的耗氧量和耗氧率;通过实时定量PCR检测线粒体DNA含量和DNA转录情况;通过荧光染色观察U251细胞镜下立体外形变化;通过Western blot观察与线粒体动态学相关蛋白表达的改变;通过si RNA和特异的抑制剂mdivi-1干扰线粒体分裂蛋白表达,观察U251细胞的生物学行为变化,证实了4EGI-1对U251细胞的作用以及与肿瘤细胞内线粒体功能的关系。我们的结论是:1.在胶质瘤U251细胞内,4EGI-1通过影响eIF4G而非eIF4E以及4E-BPs来抑制eIF4F复合物的表达。2.在胶质瘤U251细胞内,4EGI-1通过诱导氧化应激反应抑制细胞增殖并且诱导细胞凋亡。3.在胶质瘤U251细胞内,4EGI-1可以降低线粒体呼吸活动但并不影响线粒体生物合成。4.在胶质瘤U251细胞内,4EGI-1影响线粒体动态平衡蛋白的表达从而发挥肿瘤抑制作用,其中线粒体分裂蛋白Drp-1发挥了重要作用。
【关键词】：4EGI-1 人胶质瘤U251细胞 eIF4F复合物 线粒体功能障碍 基因治疗
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 缩略语表4-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-29
• 第一部分 4EGI-1 影响U251细胞内eIF4F复合物的形成29-36
• 1 材料29-30
• 2 方法30-32
• 3 结果32-33
• 4 讨论33-36
• 第二部分 4EGI-1 影响U251细胞的增殖、凋亡和氧化呼吸作用36-44
• 1 材料36-37
• 2 方法37-39
• 3 结果39-41
• 4 讨论41-44
• 第三部分 4EGI-1 未改变U251细胞的线粒体生物合成44-49
• 1 材料44-45
• 2 方法45-46
• 3 结果46-47
• 4 讨论47-49
• 第四部分 4EGI-1 通过Drp-1 诱发U251细胞的线粒体动态学改变49-57
• 1 材料49-50
• 2 方法50-52
• 3 结果52-54
• 4 讨论54-57
• 小结57-59
• 参考文献59-76
• 个人简历和研究成果76-78
• 致谢78

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本文编号：774074