1 Gag蛋白的重组、表达与应用

发布时间：2016-12-12 08:14

本文关键词：现代教育技术应用的伦理审视，由笔耕文化传播整理发布。

《西北大学》 2004年

HIV-1 Gag蛋白的重组、表达与应用

卫阳

【摘要】：获得性免疫缺陷综合症(acquired immunoceficiency syndrome，AIDS)是当今世界影响最大，危害也最大的疾病之一，它的防治迫在眉睫。人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是AIDS的病原体，其中编码核心蛋白的gag基因是HIV基因中最保守的一段。含有p24和p17的核心蛋白，又称Gag蛋白具有一定的抗原性，而且抗Gag蛋白的抗体是HIV感染后可从血液中最早检出的抗体，，因此HIV-Gag蛋白对AIDS的检测有着重要的作用。本文主要是对HIV-gag基因的重组、表达和应用进行了研究。目的研制HIV抗体诊断试剂。方法根据从Genbank上查询到的HIV-gag基因的序列，分别设计了上游引物(gagF)：5’-CGGATCCA ATG GGT GCG AGA GCG TCA-3’和下游引物(gagR)：5’-CGGAATTCGT GTC GTT GCC AAA GAG TGA-3’。用聚合酶链反应(PCR)的方法从HIV-1的基因中扩增出gag的DNA。经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后，用T4 DNA连接酶将gag的DNA插入表达载体pTrcHis2 A质粒中，构成重组的gag-pTrcHis2 A质粒。将此重组质粒转化原核表达菌株BL21(DE3)中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。表达的蛋白用Ni~(2+)亲和层析柱纯化后做SDS-PAGE检测，以及蛋白印迹(Western blot，Wb)和间接ELISA实验的应用研究。结果 SDS-PAGE电泳显示，表达的蛋白相对分子质量为41kD，与预计的值相同；蛋白印迹实验显示，阳性血清和阴性血清的检出符合率分别为100％(10／10)和100％(40／40)；ELISA实验显示，10ng重组的Gag抗原与稀释了100倍的血清反应，阳性血清和阴性血清的检出符合率分别为100％(10／10)和100％(80／80)。结论所研制的重组Gag蛋白正确表达，而且具有较高的抗原特异性和敏感性，可用于制备HIV抗体诊断试剂。

【关键词】：
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R512.91
【目录】：

摘要7-8

ABSTRACT8-9

第一部分前言9-19

1 艾滋病及其流行状况简介9-10

2 HIV简介10-13

2.1 HIV的结构10-12

2.1.1 基因组11

2.1.2 病毒蛋白11-12

2.2 HIV的生活周期12

2.3 HIV的主要生物及物理特性12-13

3 Gag抗原的抗HIV的保护功能13

4 HIV的检测13-17

4.1 HIV检测中的重要抗原及Gag抗原抗体的特性13-14

4.2 常用的HIV的实验方法14

4.3 标准的血清学实验14-17

4.4 p24抗原检测HIV感染17

5 国内外的HIV检测研究状况17-18

6 论文研究内容18-19

第二部分实验内容19-36

1 材料与仪器19-21

1.1 质粒与菌种19-20

1.2 主要试剂及材料20

1.3 主要仪器20-21

2 方法21-27

2.1 目的基因的克隆与鉴定21-22

2.1.1 目的基因片断的PCR扩增21-22

2.1.2 目的基因PCR扩增产物的纯化22

2.1.3 目的基因PCR扩增产物的酶切鉴定22

2.2 重组载体的构建与鉴定22-24

2.2.1 双酶切载体质粒22

2.2.2 双酶切目的DNA22

2.2.3 连接目的DNA和质粒22-23

2.2.4 重组质粒转入Top 10感受态细胞进行扩增23

2.2.5 重组质粒快速检测23

2.2.6 制备重组质粒并鉴定23-24

2.2.7 重组质粒的电泳鉴定24

2.2.8 重组质粒的双酶切电泳鉴定24

2.3 表达菌株的筛选24-25

2.3.1 重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞24

2.3.2 诱导表达24

2.3.3 SDS-PAGE电泳检测24-25

2.4 表达的Gag蛋白Ni-NTA分离纯化25-26

2.4.1 表达细胞的裂解物的制备25

2.4.2 Ni-NTA柱的准备25

2.4.3 变性条件下纯化25-26

2.5 透析浓缩及复性26

2.6 测蛋白含量26

2.7 表达蛋白作蛋白印迹(Western Blotting)检测26-27

2.8 抗原的间接酶联免疫应用27

3 结果27-34

3.1 大肠杆菌BL21(DE3)表达重组质粒gag-pTrcHis2 A的构建策略27-28

3.2 gag基因的PCR克隆与鉴定28

3.3 重组载体的构建与鉴定28-29

3.4 重组蛋白的表达、纯化与鉴定29-30

3.5 重组蛋白的纯化30-31

3.6 透析浓缩及复性后蛋白质浓度的计算31-32

3.7 Western blot32-33

3.8 ELISA的应用研究33-34

4 讨论34-36

第三部分小结36-37

参考文献37-42

致谢42

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