痕量DNA中关于单核苷酸多态类型ABO血型测定方法的改进和应用

发布时间：2015-03-15 21:41

第一章研究背景

短串联重复序列（Short Tandem Repeats，STRs)广泛分布于人类基因组中，重复序列为2~6bp,重复次数从数次到数十次不等，其片段长度大多在400bp以下。STRs基因座以高灵敏度、高特异性以及标准化分型等特点成为了目前法医DNA分析中的主要遗传标记[1]。最早发现的STR序列是由TG串联重复组成的长度可变序列。绝大多数STR序列位于非编码区，极少数分布在基因组的编码区域。STR扩增片段长度一般为100bp-400bp之间，联合检测：10-13个STR基因座，平均匹配概率可以达到10-9,具有很高的个体识别能力。从实际应用价值来看，用于法医学领域的STR基因座应具备扩增长度相对较短，较高的杂合度，有规律的4个或5个核苷酸重复，突变率低以及高度种属特异性等特点。在大多数法医DNA检验的实际案件中，所得到的现场检材往往很多都已腐败，甚至是高度腐败，在此类法医学检材中DNA分子受到损害，DNA链发生断裂，使DNA分子的完整性受到极大破坏。应用STRs分型会出现基因漏扩或优势扩增等现象，影响最终的分型结果，从而给法医学实际应用带来极大的困难。
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第二章在痕量DNA中SNaPshot检测ABO血型方法的构建与优化

2.1材料和方法
在案件缺乏足够信息使得侦破工作陷入停顿时，通过法医物证学相关的技术手段分析与表型相关的DNA突变，进而获得与表型相关的体征信息，可以有效地缩小拉网式排查范围，为案件的早日突破提供积极的帮助。ABO血型是重要的人类遗传表征，在法医物证研究领域作为第一代常规法医学检测项目被广泛应用，对ABO血型的检测方法己从最初的血清学反应发展到了 DNA检测的阶段。目前，绝大多数法医学实验室都能够通过对DNA进行分析得到较为可靠的ABO血型分型结果，这为无血痕案件的侦破提供了重要线索。在前期的文献检索中发现：Doi Y.等利用位于ABO基因上的6个SNPs位点构建了一种基于SNPs位点的血型检测方法，并从灵敏度以及物种特异性等方面对该方法进行了全面的评估[38]。

2.2实验结果
在本章中，完成了对10份指纹上皮脱落细胞的WGA扩增，并进行ABO血型的SNaPshot检测，以口腔拭子作为阳性对照，所有10份样品均得到检出，其结果与血清学检测一致，说明参考文献的方法适用于痕量指纹上皮脱落细胞DNA检材。在整个实验过程中发现了一些需要注意的操作步骤，具体讨论如下：1)痕量DNA模板的提取与WGA扩增污染是偶然意外的物质进入了法医学样本，从而影响DNA证据的识别与认定。这些污染物可能是生物性的或是非生物性的，外源性污染既对法医学样本产生影响，也对最终的鉴定结果产生影响。从法医物证学的角度看，若污染是来自于人的生物物质，比如上皮脱落细胞，这种类型的污染会直接影响到最终的DNA证据，严重影响到该法医学证据的证明价值，甚至会导致错误结论，从而导致严重的社会影响及公众对司法的信心。

第二章在痕量DNA中SNaPshot检测ABO血型方法的构建与优化..... 25

2.1材料和方法........ 27

第三章在痕量DNA中SNaPshot检测ABO血型方法的应用评估...... 47

3.1材料与方法...... 47

3.2实验结果.......... 48

3.3实验讨论..... 62

第四章总结与展望...... 64

第三章在痕量DNA中SNaPshot检测ABO血型方法的应用评估

3.1材料与方法
GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit (Sigma, U.S.)，ABIPRISMSNaPshotMaitiplexKit (AppliedBiosystems, U.S.)，EasyTaqDNApolymerase(北京 TansGen 公司），Alkaline Phosphatase(Shrimp) (Takara (大连）公司），ExonucleaseI (Takara (大连）公司），通用型DNA纯化回收试剂盒（天根生物技术公司，北京），GeneScan?-120 LIZ Size Standard (Applied Biosystems，U.S.)，Hi-DiFormamide ( Applied Biosystems, U.S.)，BigDye Terminator v3.1(Applied Biosystems，U.S.)，POP4 液体胶（Applied Biosystems，U.S.), NaCl(Sigma,U.S.) MgCkCSigma,U.S.)，Tris(Sigma, U.S.)，Tween-20(Sigma, U.S.),NP40 (Sigma, U.S.), ChelexlOO (Bio-Red, U.S.)；主要仪器.

3.2实验结果
在收集到的48份样品中，血清学检测的结果是A型16份，B型11份，0型18份，AB型3份。对48份样品使用SNaPshot技术进行ABO血型基因型分型，全部48份指纹上皮脱落细胞均得到检出，47份口腔拭子得到检出（第32号样品的口腔拭子由于操作失误在处理过程中损失）。检出的47份结果能够完全匹配。其具体数据为：在血清学判定为A型的16份样品中AA型3份，AOA型4份，A0°型9份；在血清学判定为B型的11份样品中BB型1份,BQA型9份，，BQG型1份；在血清学判定为?型的18份样品中QAQA型7份，QGQG型2份，OAQG型9份；在血清学判定为AB型的3份样品中AB型3份。
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第四章总结与展望

随着身份认证及表型相关的SNPs技术体系的构建，法医物证学中一个“DNA智能化”的新时代正在拉幵序幕。随着从现场采集到的法医学检材中使用SNPs预测可见特征（Externally Visible Characteristics, EVC )的能力日益增强，通过EVC预测对嫌疑人的相貌进行“DNA画像”为警方寻找嫌疑人提供有力帮助，特别是遇到常规DNA扩增技术无法使用的情况，在面对一些“冰冻案件”时可以有效的缩小拉网排查的范围。随着司法实践的不断深入、检测技术手段的不断改进和法医物证学数据的不断积累，特别是全球范围内诸多法医学实验室不断加强技术合作，积累到不同地区的法医学SNPs分型数据，在不久的将来基于SNPs的法医学数据库构建将会从提议变为现实，为法医物证学提供新的工具。

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参考文献（略）

本文编号：17981