基于核酸适配体的非标记荧光技术检测甲基苯丙胺

发布时间：2020-09-21 21:48

　　 甲基苯丙胺又称甲基安非他明,是一种中枢神经兴奋剂,当甲基苯丙胺进入体内后,使大脑内的多巴胺和5-羟色胺大量增加,从而产生欣快感并引起幻觉。根据相关统计数据,2017年我国毒情呈现出合成毒品滥用规模居首位的特点,占全国吸毒人员的60.5%。同时,甲基苯丙胺对人身体健康造成极大危害,反复吸食会成瘾,过量则会死亡;并且对社会的安定和谐构成极大的威胁,因此,研究甲基苯丙胺的现场检测方法对公共安全的维护意义重大。本文通过对甲基苯丙胺的检测技术发展和基于核酸适配体的非标记荧光技术进行总结,利用简单化学合成,制备了一种基于傒基的荧光探针PBIs,通过改性,该探针具有良好的水溶性和稳定的荧光性能,同时,利用适配体的特异性识别功能,构建了一种非标记的荧光传感体系,用于甲基苯丙胺的检测;并对检测条件进行了优化,研究了该传感体系检测甲基苯丙胺的机制;随后对尿液中的甲基苯丙胺进行了检测。主要内容如下:1、以傒-3,4,9,10-四羧酸二酐、三(2-氨基乙基)胺、甲酸、甲醛、碳酸钠、甲醇、碘甲烷为反应物,制备了一种具有水溶性的荧光探针PBIs,并对探针的结构进行了表征。随后考察了探针PBIs的荧光性能,确定了最佳激发波长,并对探针浓度等条件进行了优化。2、使用探针PBIs和适配体初步构建了一种荧光传感体系,分别运用了适配体单链竞合、双链(适配体-互补链)和单链适配体-I型核酸外切酶三个策略,对该荧光传感体系检测甲基苯丙胺的可行性进行了探究,首先使用适配体对探针PBIs进行了荧光滴定实验,确定了适配体的最佳浓度;再运用上述三个策略对甲基苯丙胺进行了检测,分别测定了体系在548 nm处的荧光强度值,实验结果表明,运用单链适配体-I型核酸外切酶策略,甲基苯丙胺浓度在0-10μmol/L范围内,与体系荧光强度值呈现良好的线性关系,并利用公式推算出了检测限。3、考察了单链适配体-I型核酸外切酶策略对甲基苯丙胺的可视化检测、特异性和抗干扰能力等内容。在手提紫外线分析仪的激发下,当甲基苯丙胺浓度大于20μmol/L时,裸眼可以清晰辨别荧光的变化;在特异性和抗干扰能力方面,单链适配体-I型核酸外切酶策略表现出良好的特异性和抗干扰能力。4、对适配体单链竞合、双链(适配体-互补链)和单链适配体-I型核酸外切酶三个策略的检测结果进行了对比,确定了单链适配体-I型核酸外切酶为该荧光传感体系的最佳检测方案;并分析了单链适配体-I型核酸外切酶策略检测甲基苯丙胺的机理。5、通过设置加标回收试验,考察了单链适配体-I型核酸外切酶策略检测尿液中甲基苯丙胺的可行性,利用空白尿液,模拟了吸食甲基苯丙胺之后的尿液,结果表明该策略具有较高的准确度和稳定性。随后对吸毒者尿液的进行检测,体系的荧光发生较大变化,同时,辅以GC-MS检测结果来进行佐证,进一步证明了该策略可以用于尿液中甲基苯丙胺的定性检测。
【学位单位】：中国人民公安大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：O657.3;D918.9
【部分图文】：

中国人民公安大学硕士学位论文的DNA进行扩增，变性成单链以备下一轮筛选；若为RNA SELEX，则需要-聚合酶链反应（RT-PCR）来实现RNA的扩增。扩增得到的产物形成寡核苷新一轮的筛选。这三步组成了SELEX技术的一个循环周期。分离被筛选出的X筛选结束。5-15轮的SELEX筛选后，解离常数（Kd）在皮摩尔到纳摩尔范成含有高亲和力的核酸序列。然而，传统的SELEX技术在获得高质量的适配存在技术瓶颈，为了缩短筛选周期和提高结合率，CE-SELEX[18]、MAI-SEIS-SELEX[20]、ES-SELEX[21]、MSD-SELEX[22]等新的筛选技术已被成功地运适配体的筛选。

[27]利用适配体和 PicoGreen 构建了一种非标记的检测法。PicoGreen 是一种新型的商业化染料，如图1.3所示，它与dsDNA结合产生很强的荧光信号，游离于溶液中不产生荧光。实验原理为：将适配体与等体积的 cDNA 杂交，得到具有双链结构的aptamer/cDNA，随后加入含有靶物和能够嵌入双链的 PicoGreen 混合溶液。混合后的产物夹在盖玻片和镀有银膜（SIFs）的载玻片之间，靶物与适配体竞相结合使aptamer/cDNA 的双链结构被破坏，释放出 PG 染料和 cDNA，游离 PG 染料不与单链的cDNA 结合

图 1.4 G4-DNA 嵌入型染料噻唑橙检测卡那霉素还有一类嵌入型的染料是以静电吸附的方式聚集在适配体上，游的荧光，但与适配体结合后，由于聚集荧光淬灭效应，荧光信号]合成了一种水溶性傒酰亚胺染料（PTCDI），PTCDI以单体的形两个正电荷，电荷间的斥力降低了它的堆积，从而显示出很强的于凝血酶的适配体包含多个带负电荷的磷酸基团，它是一种阴用下，PTCDI单体吸附到适配体上，由于聚集诱导荧光淬灭效应靶标凝血酶，适配体与凝血酶结合形成G-四链体结构，释放PT。该方法的检出限为40 pmol/L。Wang[37]等运用相同的技术和溶菌酶的适配体检测了溶菌酶，检出限为0.07 nmol/L。

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本文编号：2824031