甲拌磷急性中毒相关基因在大鼠脏器的表达研究

发布时间：2017-05-25 21:12

  本文关键词：甲拌磷急性中毒相关基因在大鼠脏器的表达研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测大鼠脏器中(心、肝、肺、脑和肠)甲拌磷中毒相关基因(ACh E、BCh E、PON-1和FOS)m RNA的表达,筛选出表达变化有统计学意义的脏器和中毒相关基因;检测中毒相关基因在中毒致死大鼠脏器中的m RNA表达量,探讨甲拌磷中毒相关基因m RNA表达变化在中毒死亡时间推断的可行性,在法医学中为甲拌磷中毒死亡时间的推断提供科学的依据。方法:健康成年雌性SD大鼠24只,随机分为空白对照组、急性中毒死亡组、中毒死亡1d组和中毒死亡7d组。急性中毒死亡组、中毒死亡1d组和中毒死亡7d组分别用3LD50的甲拌磷对大鼠进行灌胃,死亡后分别立即解剖取心、肝、肺、脑和肠,放置1d后解剖取肝脏和放置7d后解剖取肝脏。空白对照组用同样体积的生理盐水对大鼠进行灌胃,乙醚麻醉后立即解剖取心、肝、肺、脑和肠,实验组和空白对照组所取样本重量均约为30mg,取材后立即置于液氮中保存待检。各样本用TRIzol总RNA提取试剂TRIzol Reagent提取总RNA,1%非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测总RNA纯度、浓度及其完整性,以β-actin作为内参基因,将总RNA逆转录合成c DNA,梯度浓度稀释c DNA原液,分别建立ACh E、BCh E、PON-1、FOS和β-actin的相对定量标准曲线;SYBR Green I嵌合荧光法实时定量PCR技术检测各目的基因m RNA相对表达量,进行统计学分析,研究其在中毒致死大鼠脏器表达量的变化。结果:提取的总RNA经1%非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测纯度、浓度及其完整性较好,均可满足后续实验要求。内参基因β-actin与目的基因ACh E、BCh E、PON-1和FOS的扩增效率分别为109.2%、100.9%、108.7%、105.3%和100.91%,一致性较好,说明内参基因选择正确;扩增曲线为光滑的S型曲线,基线较平,拐点清楚,平台期平行性较好,说明反应过程良好,没有非特异性产物出现,引物设计良好且特异性强;β-actin基因熔解温度为85°C,ACh E、BCh E、PON-1和FOS基因熔解温度分别为87.5°C、82.5℃、81.5℃和89℃,熔解曲线是单一的较高的尖峰,底部平而窄,无杂峰出现,说明这些基因扩增的特异性较强,没有引物二聚体的出现。急性中毒死亡组目的基因ACh E、BCh E、PON-1和FOSm RNA在大鼠心脏中表达分别为空白对照组的8.79倍(P0.05)、1.86倍(P0.05)、45.64%(P0.05)和1.15倍(P0.05);肝脏中分别为空白对照组的8.59倍(P0.05)、1.89倍(P0.05)、1.09倍(P0.05)和3.60倍(P0.05);肺中分别为空白对照组的5.44%(P0.05)、67.00%(P0.05)、1.11倍(P0.05)和3.99倍(P0.05);脑中分别为空白对照组的10.69%(P0.05)、92.54%(P0.05)、2.12倍(P0.05)和13.91%(P0.05);肠中分别为空白对照组的8.01%(P0.05)、1.08倍(P0.05)、0.84%(P0.05)和49.86%(P0.05)。中毒死亡1d组目的基因ACh E、BCh E、PON-1和FOSm RNA在大鼠肝脏中表达分别为空白对照组的53.92倍(P0.05)、33.64%(P0.05)、46.25%(P0.05)和1.33倍(P0.05);中毒死亡1d组各目的基因m RNA在大鼠肝脏中表达分别为急性中毒死亡组的6.27倍(P0.05)、17.80%(P0.05)、42.43%(P0.05)和37.02%(P0.05)。中毒死亡7d组肝脏中提取的总RNA经1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测发现已无明显的条带(18S和28S),逆转录经RT-PCR扩增后也无明显的S型扩增曲线,说明7d后各基因的总RNA已降解,可认为其表达量为0。结论:除了PON-1基因以外,肝脏中ACh E、BCh E和FOS基因m RNA的表达均有统计学意义,可以作为甲拌磷急性中毒相关基因表达研究的靶器官;BCh E基因在心脏和肝脏中表达稳定且有统计学意义,可以作为甲拌磷急性中毒的基因表达标志;急性中毒死亡组、中毒死亡1d组在肝脏中BCh E基因m RNA的表达分别为空白对照组的1.89倍(P0.05),33.64%(P0.05),表现出先增高后降低的趋势,与急性甲拌磷农药中毒死后放置时间存在一定的关系,其时序性变化可望作为急性甲拌磷中毒死亡时间推断的指标之一,但是由于时间点太少,有待于探索7d内该基因m RNA具体变化趋势;实时荧光定量PCR技术对于分子水平的改变的检测具有较高的敏感性和准确性,适合法医学实验研究和案件侦破的需求。
【关键词】：急性甲拌磷中毒 中毒相关基因 实时荧光定量PCR 死亡时间
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：D919
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-13
• 第一部分 甲拌磷急性中毒致死大鼠脏器中中毒相关基因的表达研究13-40
• 1 材料与方法13-19
• 2 结果19-40
• 第二部分 中毒相关基因随死亡时间在大鼠肝脏中的表达研究40-54
• 1 材料与方法40-42
• 2 结果42-54
• 讨论54-59
• 小结59-61
• 参考文献61-64
• 综述64-70
• 参考文献68-70
• 致谢70-71
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果71-72
• 个人简历72

【参考文献】

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1 喻洪江;，

本文编号：395014