草酸青霉纤维素酶合成调控机制研究及高产菌株构建

发布时间：2018-03-07 12:56

  本文选题：草酸青霉　切入点：纤维素酶　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：光合作用制造的植物生物质是地球上最为丰富的可再生资源。开发和转化这类大宗底物为生物燃料或化学品是解决我国面临的能源和环境危机的重要途径。然而, 高成本的纤维素酶是制约木质纤维素乙醇商业化的主要瓶颈。在自然界中,许多丝状真菌可以分泌大量的木质纤维素降解酶。因此,这些微生物被开发利用,并成为商品酶制剂的主要生产者。丝状真菌的纤维素酶在转录水平上受到严谨的控制。草酸青霉是本实验室筛选获得的纤维素酶高产菌株,其突变菌株已成功用于工业纤维素酶的生产,并拥有自主知识产权。 研究表明,在草酸青霉中,存在着尚未阐明的转录调控机制。本实验室前期工作借助二代测序手段开展了野生菌株和高产突变株的比较基因组学研究,发现氨基酸发生变异的蛋白质中显示了转录因子活性的富集。这些结果暗示了在纤维素酶降解真菌草酸青霉中许多转录因子及其介导的转录调控机制决定了纤维素酶的产量,并且在纤维素酶的表达网络中处于核心位置。为了深入理解影响纤维素酶合成的转录调控机制,并系统解析突变株高产的分子机理,进而改造纤维素酶的表达调控网络以进一步提高菌株的产酶能力,我们围绕几个关键的转录因子开展了一系列的研究工作,取得了重要进展。1.解析了转录因子ClrB, CreA, AmyR和XlnR调控纤维素酶表达的分子机理研究结果表明,ClrB是调控纤维素酶表达的关键激活因子,它的缺失不仅抑制草酸青霉在纤维素平板上的生长,并且几乎阻断了所有主要纤维素酶基因的表达。clrb敲除株与野生株之间的比较转录组学研究发现,ClrB依赖的生物学过程主要涉及植物生物质多糖的降解利用和寡糖的转运,表明ClrB是纤维素酶专属转录调控因子。CreA是抑制纤维素酶表达的关键阻遏蛋白,敲除creA基因不仅可以显著提高纤维素酶表达,而且可以上调激活因子ClrB的水平。此外我们还发现,CreA还参与了丝状真菌的营养生长和无性发育等过程的调控。AmyR正向激活淀粉酶的表达,同时反向抑制了纤维素酶的表达。AmyR的缺失阻断胞外淀粉酶的合成,但是大幅度提升了纤维素酶的产量。XlnR在草酸青霉中主要调控半纤维素酶基因的表达活性,同时在一定程度上影响了纤维素酶基因的表达。总之,转录因子ClrB, CreA, AmyR和XlnR是决定草酸青霉纤维素酶表达活性最为核心的4个转录调控蛋白。2.转录因子剂量依赖性及蛋白互作介导的协同性决定了纤维素酶基因的表达水平及纤维素酶产量。过表达激活因子ClrB或XlnR显著上调纤维素酶基因表达水平, 增加了纤维素酶的产量。而过表达阻遏蛋白CreA显著下调纤维素酶基因的表达,进而减少胞外水解酶的分泌。这些研究结果表明,纤维素酶的水平与转录激活因子ClrB或XlnR的水平成正相关,而与阻遏蛋白CreA或AmyR的水平成负相关。更为重要的是, 同时过表达激活因子ClrB和XlnR显著协同增强纤维素酶的表达活性。缺失CreA或AmyR组合过表达激活因子ClrB (gpd(P)::clrB-ΔcreA和gpd(P)::clrB-ΔamyR)同样能协同提高纤维素酶的表达水平和纤维素酶产量。有趣的是,突变株gpd(P)::clrB-ΔcreA在不依赖诱导物时所分泌的纤维素酶量相当于纤维素诱导条件下野生型菌株的纤维素酶产量。同时缺失CreA和AmyR在诱导纤维素酶表达中也显示了明显的正协同效应。总之,进一步分析双基因突变株gpd(P)::clrB-gpd(P)::xlnR, gpd(P)::clrB-gpd(P)::creA, gpd(P)::clrB-ΔamyRΔ amyR-ΔcreA和gpd(P)::clrB-AcreA中纤维素酶的表达水平,并与各自对应的单基因突变株进行比较研究的结果进一步明确了转录因子剂量所维稳的“跷跷板模型”在草酸青霉纤维素酶表达调控中发挥了关键作用。纤维素酶基因的表达水平和纤维素酶产量与激活因子XlnR或ClrB剂量成正相关, 而与阻遏蛋白CreA 或剂量成负相关。转录因子AmyR与ClrB和XlnR之间的互作得到了酵母AmyR双杂交(Y2H)和双分子互补荧光证据的强烈支持,这种互作也被认为(BiFC)在协同调控纤维素酶表达中发挥了重要作用。凝胶阻滞试验证实了转录因子和ClrB, CreA通过直接结合纤维素酶基因的启动子发挥调控作用。对转录XlnR因子和CreA相关突变株的比较蛋白质组学分析,发现了不同的木质纤维素ClrB酶组分对转录因子的差异响应。3.功能鉴定了核小体重塑复合物RSCA,发现其参与了营养生长,CWI,纤维素酶表达等生物学过程。初步探索了核小体重塑蛋白RSCA在丝状真菌中的生物学功能。基因敲除研究明确了RSCA对于保持细胞壁完整性是非常关键的。其中一个关键的几丁质合酶的表达是严格依赖活性RSCA的。本研究首次发现了核小体重塑蛋白RSCA参与草酸青霉纤维素酶基因的表达调控,并且与阻遏蛋白CreA互作。RSCA和CreA在纤维素酶表达调控中相互作用的分子机制尚需要深入研究。4.鉴定和功能研究了转录因子PoFlbC,并明确了其在草酸青霉纤维素酶表达中的关键作用鉴定了构巢曲霉上游发育调控因子FlbC在草酸青霉中的直系同源蛋白PoFlbC。基因敲除研究表明,PoFlbC的缺失导致了主要生孢基因brlA的表达下调及分生孢子产量的降低。而过表达菌株OEPoflbC在分生孢子的发生和产量方面也表现出一定的缺陷。这表明草酸青霉的分生孢子形成受到PoFlbC的平衡调控,可能同时受到PoflbC过表达的反馈抑制。尽管在曲霉中,与生孢相关的上游调控因子已经得到了广泛的研究,但是青霉属中同源蛋白的功能研究只有零星的报道。我们首次揭示了PoFlbC在纤维素酶的表达中也发挥了至关重要的作用。转录组学分析发现,PoFlbC的缺失导致了几乎所有的纤维素酶和部分半纤维素酶基因的表达下调。有趣的是主要多糖裂解酶AA9-A(以前命名为GH61A)编码基因的诱导表达严格依赖于活性PoFlbC。这些结果暗示,PoFlbC有可能特异性地调控多糖裂解酶所主导的木质纤维素的氧化降解过程。5.理性重构纤维素酶的表达调控网络,构建纤维素酶高产菌株基于上述研究结果,我们对草酸青霉野生菌株114-2进行了系统的遗传工程改造：增强诱导调控同时降低阻遏效应。通过组合过表达了转录因子ClrB和双敲除CreA及胞内p-葡萄糖苷酶BGL2,实现了对草酸青霉纤维素酶的表达调控网络重构,获得了纤维素酶高产突变株RE-10。RE-10的纤维素酶活力和分泌的胞外蛋白量相较于野生菌株分别提高了30倍和10倍。更重要的是,RE-10的纤维素酶产量甚至超过了长期诱变选育出的工业菌株JU-A10-T。比较分泌组学研究证明,在RE-10中参与木质纤维素降解的蛋白包括纤维素酶,半纤维素酶,多糖裂解酶的丰度表现出特异性的上调。美中不足的是,RE-10中的β-葡萄糖苷酶并没有以相应幅度提高。所占比例反而有所下降。因此,为了弥补RE-10中p-葡萄糖苷酶活力的不足,我们分别采用两种策略在RE-10中过表达p-葡萄糖苷酶。来自核糖体40S蛋白S8的启动子被用于过表达3种β-葡萄糖苷酶(BG1, BG4,和BG5)。所有的突变株的BG酶活,转录本丰度和蛋白量均明显提高。胞内p-葡萄糖苷酶bgl2.基因的启动子也被用于诱导性地表达BGL1和BGL4。这种诱导表达策略进一步增强了p-葡萄糖苷酶的表达活性。BGLl的过表达菌株I1-13的p-葡萄糖苷酶活相较于RE-10提高了65倍,高达150 U/ml,显著高于已报道的其他高产菌株所分泌的粗酶液中的BG水平。所有的这些BGL过表达突变株都增强了对微晶纤维素的利用及滤纸的水解。BGL突变株的粗酶液对脱木素木糖渣(DCCR)的水解效率相较于出发菌株大幅度提升,显著降低了酶的用量。值得一提的是,BGL4过表达突变株粗酶液的转化率在糖化前期基本上与经过改良的商品酶相当。本研究所建立的理性的菌株遗传工程改造实现了在基因调控层面对菌株的酶系进行改良和优化,减少了酶系浓缩,复配,添加等一系列耗时费力的下游生物加工工艺,在纤维素乙醇的商业化生产中显示了光明的前景。总之,这些研究成果不仅有助于草酸青霉纤维素酶表达调控网络模型的完善,丰富了对丝状真菌纤维素酶复杂的转录调控机理的认识,而且为纤维素酶高产菌株的改造提供了重要的靶点。通过遗传工程策略,理性重构了草酸青霉纤维素酶表达调控网络,获得了高产突变株RE-10。进一步在其中过表达p-葡萄糖苷酶,显著改良了其酶系组成和酶解效率。此外,我们还在青霉属真菌中首次功能鉴定了发育调控因子PoFlbC,并且在分子层面揭示了其共调控分生孢子发生和纤维素酶表达的机制。首次功能鉴定了丝状真菌中的核小体重塑蛋白复合物组分RSCA,并对其参与的生物学过程进行了相关研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q55;Q78
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本文编号：1579392