鲍鱼菇多糖的分离纯化及抗肿瘤机制研究

发布时间：2019-04-02 08:25

【摘要】：我国是食用菌种植大国。食用菌多糖因其极高的营养价值和药用价值已经成为国内外研究热点。鲍鱼菇(Pleurotus abalonus Han, K.M.Chen et S.Cheng)为担子菌类松茸科(Tricholomataceae)侧耳属,食用菇菌类。目前,对鲍鱼菇多糖的研究尚处初级阶段,关于其化学特征和抗肿瘤研究少有报道。在本实验室前期对多种食用菌粗多糖进行抗肿瘤筛选结果发现,鲍鱼菇粗多糖有较好的抗肿瘤效应。为了进一步阐述鲍鱼菇多糖的抗肿瘤作用,研究其构-效关系,本研究拟对鲍鱼菇多糖进行提取分离纯化,并深入研究其抗肿瘤机制。本研究通过本实验室已经优化过的水提醇沉结合超声辅助法得到鲍鱼菇粗多糖,得率为3.34%。并进一步通过Sevag除蛋白,活性炭吸附法脱色后,再经DEAE-52纤维素离子交换柱分离得到3个主要组分(对应洗脱液分别为0,0.05,0.1M氯化钠溶液)。经G-100葡聚糖凝胶柱层析,所收集的3个组分均为均一组分,命名为PAP-1、PAP-2和PAP-3。通过MTT和LDH实验发现,相比PAP-1和PAP-2, PAP-3对人乳腺癌细胞MCF-7有显著的抗肿瘤作用,IC50为193μg/mL。对PAP-3进行PMP柱前衍生化,结合HPLC-UV分析结果显示,PAP-3是由8种单糖组成,其组分及相应的摩尔百分比依次为甘露糖(Mannose,12.1%)、核糖(Ribose,10.4%)、鼠李糖(Rhamnose,3.1%)葡萄糖醛酸(Glucuronic Acid,2.7%)、半乳糖醛酸(Galacturonic Acid,6.7)、葡萄糖(Glucose,23.5%)、半乳糖(Galactose,19.2%)和阿拉伯糖(Ara,19.5%),其中半乳糖醛酸含量最高,达到41.7%,接下来是葡萄糖和半乳糖,含量分别为29.8%和14.6%。高效液相凝胶渗透法测得PAP-3的分子量为3.68x105Da。对筛选得到的PAP-3抗肿瘤机制做了深入研究。DAPI染色实验发现PAP-3引起MCF-7细胞出现核碎裂、凋亡小体等细胞凋亡特征,激光扫描共聚焦显微镜观察到PAP-3引起MCF-7细胞磷脂酰丝氨酸外翻,证实PAP-3可以诱导MCF-7细胞凋亡。进而通过流式细胞仪结合Annexin V-FITC/PI染色法对MCF-7细胞凋亡做了定量检测,结果显示200μg/mL的PAP-3作用MCF-7细胞48小时后出现20.48%的早期凋亡和29.39%的晚期凋亡。通过进一步的研究发现PAP-3引起MCF-7细胞凋亡线粒体跨膜电位下降,Bax、P53蛋白表达增强,Bcl-2表达减弱,Caspase-3/9和PARP被活化,说明PAP-3诱导凋亡途径为线粒体内源途径。此外,细胞周期实验结果显示,PAP-3将细胞周期阻滞在S期。激光扫描共聚焦显微镜观察和流式细胞仪检测发现,伴随PAP-3诱导MCF-7细胞凋亡和周期阻滞,细胞胞内活性氧(ROS)水平显著升高。用超氧化物歧化酶(SOD)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理MCF-7,能够显著降低胞内活性氧水平。当用PAP-3作用于经SOD和NAC处理过的MCF-7细胞中,发现PAP-3抑制肿瘤细胞增殖的能力和诱导凋亡的能力显著性降低。这一发现表明,PAP-3是通过ROS的介导作用,从而发挥其抗肿瘤机制。本研究从鲍鱼菇提取分离纯化得到3种均一多糖组分,筛选发现其中一种分子量为3.68x105Da的多糖组分PAP-3具有显著的抗肿瘤效应,其抗肿瘤效应是通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用,凋亡途径为线粒体途径。ROS在PAP-3诱导肿瘤细胞凋亡中起到了重要的介导作用。这一研究发现为开发自主知识产权的新型食品功能因子或药品提供理论依据,发挥了其巨大的潜在的经济的与社会的效益。
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【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R285.5

【参考文献】